Органические гели. Суть методики. Для проведения иммобилизации готовят реакционную смесь* главными компонентами которой являются фермент, мономер, сшивающий агент (если это необходимо) и водный буферный раствор. Иногда в смесь для полимеризации вводят также добавки, предохраняющие фермент от инактивации при гелеобразовании. Для получения геля готовую смесь подвергают воздействию какого-либо фактора, инициирующего процесс полимеризации мономеря.
Полимеризация. При проведении полимеризации обычно используемые концентрации мономера н сшивки составляют, соответственно, 30—60% и приблизительно 5% от общей массы реакционной смеси. Полимеризация протекает по радикальному механизму. Источниками радикалов, являющихся инициаторами процесса полимеризации, могут служить некоторые окислитель-но-восстановительные и фотохимические реакции, в коде которых в качестве промежуточного продукта образуются свободные радикалы. Наиболее широко применяется окислительно-восстановительная пара персульфат калия (или аммония) — N^N'.N'-тетра метил этнлендиа мин. Инициирование полимеризации достигается при внесении этих веществ в раствор мономера. В качестве фотохимического инициатора обычно используется рибофлавин; в этом случае полимеризация происходит при облучении реакционной смеси мощным источником света. Свободные радикалы, необходимые для начала полимеризации, могут генерироваться также при воздействии на раствор мономера у-нз-лучения или потока электронов. Преимущество этого способа состоит в том, что он не требует введения инициаторов в исходную смесь.
* В принципе, иммобилизацию иуп'М включения в гель можно осуществить также, пропитывай;уже готовый гель pavnjnpmi фермента. Этот способ, о.гнако, не имеет широкого практического применения, поскольку получаемые с его помощью препараты иммобилизованных фермснюв характерен у ются ничьим удель^ ной активностью, а сам процесс им.моСниичашш занимает длительное время на зв HUJKort скорости диффузии фермой г<я в порах геля. Одно Из немногих исключений составляет списанияя ниже иммобилизация на колл яге новых мембранах путем их и микширования водным растворим фермента.
При проведении иммобилизации могут возникать затруднения, обусловленные некоторыми особенностями протекания реакции полимеризации. Так, например, полимеризация ингибируется присутствующим в растворе молекулярным кислородом, и во многих случаях для его удалении рабочий раствор предварительно насыщают инертным газом — азотом или аргоном. Кроме того, в ходе полимеризации выделяется значительное количество теплоты, что приводит к повышению температуры внутри образующегося полимерного блока до 75°С. Такое сильное нагревание вызывает инактивацию ферментов, поэтому гтолимериэую-щнйся раствор необходимо охлаждать так, чтобы его температура не превышала 20—25°С.
Осложнений, связанных с ингибирующим действием кислорода и нагреванием, можно избежать, если проводить полимеризацию путем у-облучения замороженного и охлажденного до —80°С рабочего раствора. -
После окончания полимеризации, которая в зависимости от условий (природа мономеров, количество инициатора, температура и т. п.) может продолжаться от нескольких минут до нескольких часов, образуется блок полимерного геля, содержащий иммобилизованный фермент. Следует учитывать, что в геле могут оставаться примеси неизрасходованных при полимеризации мономеров н инициаторов. Чтобы избавиться от них, гель обычно механически измельчают и тщательно промывают буферным раствором. При необходимости длительного хранения измельченные частицы подвергают лиофильной сушке.
Инактивация фермента при полимеризации. В процессе образования полимерного геля фермент подвергается различным денатурирующим воздействиям, в результате чего может происходить его инактивация, вплоть до полной потери каталитической активности. Помимо уже упоминавшегося возможного разогрева при полимеризации денатурацию фермента могут вызывать компоненты реакционной смеси, в первую очередь мономер. Например, акриламид по своему денатурирующему воздействию на ферменты близок к мочевине. С другой стороны, солиакрнл-амид этим свойством не обладает- Именно поэтому обязательной стадией иммобилизации является тщательная промывка полимерного геля от оставшихся примесей мономера и инициатора.
Инактивация фермента может происходить под действием свободных радикалов, образующихся при радикальной полимеризации. Для защиты фермента от неблагоприятных воздействий в реакционную смесь иногда вводят стабилизирующие добавки. В роли таких добавок могут выступать, например, инертные белки (обычно альбумин) или вещества, являющиеся субстратами или продуктами реакции, катализируемой данным ферментом.