Определение активности фосфатаз

Фосфатазы - это ферменты, отщепляющие остаток фосфорной кислоты от ее органических эфирных соединений. Они участвуют в минеральном (фосфорно-кальциевом) обмене. Не рекомендуется использовать при определении активности ЩФ фтористые соединения и оксалат, ингибирующие фермент.

В зависимости от рН, при котором проявляется их наибольшая ферментативная активность, различают кислую и щелочную фосфатазу.

Щелочная фосфатаза (ЩФ) гидролизует разные синтетические субстраты при оптимуме рН 10,0. Это металлопротеид, в состав активного центра которого входит цинк. ЩФ содержится в различных органах и тканях, особенно много ее обнаруживается в растущих костях (фермент содержится в мембранах остеокластов), желчи и плаценте. Этот фермент служит биохимическим маркером фосфорно-кальциевого обмена в костной ткани, скрининговым тестом остеопороза.

Кислая фосфатаза проявляет оптимальное действие при рН=4,6. Наиболее богатым источником этого лизосомального фермента является предстательная железа, фосфатазная активность которой приблизительно в 1000 раз превышает активность этого фермента костной ткани, печени и других органах.

Методы исследования фосфатаз отличаются по используемому субстрату.

В настоящее время в клинико-лабораторной практике применяются 2 основные группы методов определения активности ЩФ:

1. Колориметрические - с измерением в конечной точке;

2. Кинетические.

Использование в качестве субстрата пара-нитрофенилфосфата позволяет осуществить оба варианта.

Принцип метода:

Субстрат пара-нитрофенилфосфат натрия подвергается ферментативному расщеплению с образованием пара- нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание.

Норма ЩФ - 1 - 3 ммоль пара-нитрофенола \ л.ч

Клинико-диагностическое значение.

Повышение активности ЩФ происходит главным образом при двух видах патологии: костных заболеваниях, связанных с пролиферацией остеобластов, и болезнях, сопровождающихся явлениями холестаза. Исследование активности ЩФ приобрело особенное значение у детей, так как ее активность повышается при рахите, причем еще до появления клинических симптомов заболевания и до снижения неорганического фосфора в крови.

Активность ЩФ увеличена на протяжении всего периода болезни и выравнивается после затихания клинических симптомов рахита. Путем определения активности ЩФ удается выявить скрытые формы рахита, а при систематическом обследовании детей и предрахитические стадии заболевания. Повышение активности ЩФ в данном случае надо рассматривать как компенсаторный механизм обеспечения потребностей организма в неорганических фосфатах. Повышение активности ЩФ встречается при заболеваниях костей, связанных с увеличением количества остеобластов, а также сопровождающихся распадом костной ткани: гипертиреоидизме, болезни Педжета (деформирующий остит), карциноме костной ткани остеосаркоме и других заболеваниях.

Повышение активности ЩФ характерно для заболеваний печени и желчных путей. Резкое увеличение отмечается при внепеченочном холестазе. При обтурационной желтухе, возникшей вследствие закупорки внепеченочных желчных протоков при камнях желчного пузыря, а также при новообразованиях в этих органах активность ЩФ повышается до 10 раз и более.

Внутрипеченочный холестаз при гепатитах, циррозе печени также сопровождается повышением ЩФ, но степень гиперферментемии значительно ниже (до 2-3 раз).

Снижение активности ЩФ возникает при ослаблении остеобластических процессов, например, при замедленном росте у детей.

Активность ЩФ уменьшается при гипотиреозе, авитаминозе С, старческом остеопорозе и т.д.

Кровь на исследование берется у пациента после голодания. Сыворотку перед определением активности щелочной фосфатазы можно хранить в холодильнике не более 48 часов, однако при этом значения активности ЩФ могут слегка понижаться (до 10%). В размороженной сыворотке активность фермента падает.

Повышение активности кислой фосфатазы (КФ), в большом количестве содержащейся в предстательной железе, при нормальном уровне ЩФ указывает на новообразование в этой железе. Возрастание активности КФ наблюдается через 1-2 сутки после оперативного вмешательства на железе, а также при ее биопсии. Не рекомендуется брать кровь для анализа активности кислой фосфатазы в течение 24 часов после массажа простаты или ее инструментального исследования. Лихорадочное состояние способно обусловить ложно завышенные результаты активности фермента.

Биологическим материалом для исследования кислой фосфатазы служит сыворотка крови. Венозную кровь следует как можно быстрее доставить в лабораторию. Пробу крови охлаждают до 4-8°С; сыворотку отделяют от сгустка (фермент присутствует в тромбоцитах и высвобождается при их активации); отбирают 1 мл сыворотки и вносят в пробирку, содержащую гидросульфат натрия (NaHSC).