Определение активности аминотрансфераз

Аспартатаминотансфераза (АсАТ) и аланинаминотрансфераза (АлАТ) – близкие по действию ферменты, при участии которых в организме человека осуществляется межмолекулярный перенос аминогрупп с аминокислот на кетокислоты. Этот процесс называется переаминированием. Значение переаминирования состоит в синтезе и разрушении отдельных аминокислот в организме.

Аминотрансферазы (АсАТ и АлАТ) являются внутриклеточными ферментами и их содержание в сыворотке крови здоровых людей невелико. Однако при повреждении или разрушении клеток, содержащих АсАТ и АлАТ (клеток печени, мышц сердца, скелетной мускулатуры и почек) происходит дополнительный выброс этих ферментов в кровяное русло, что приводит к повышению их активности в крови.

Максимальное количество АлАТ содержится в печени. При поражении клеток печени вирусами, различными химическими веществами, в т.ч. алкоголем и лекарствами, а также при нарушении оттока желчи из-за сдавливания желчного протока или его закупорке камнями активность АлАТ в крови возрастает. Поэтому определение активности фермента в сыворотке крови широко используется для диагностики болезней печени. Степень увеличения активности АлАТ, как правило, пропорциональна тяжести заболевания, в острых случаях активность фермента в сыворотке крови может превышать нормальные значения в 5-10 раз. При инфекционном гепатите повышение активности фермента происходит в очень ранние сроки. С увеличением сроков заболевания активность фермента обычно снижается, но медленно, в течение нескольких месяцев – при легком течении заболевания. Резкое увеличение ак­тивности АлАТ наблюдается и при безжелтушной форме заболевания, поэтому данный тест широко приме­няется при обследовании лиц, пребывающих в очаге инфекции. Исследование активности АлАТ обязательно для всех доноров крови для исключения хронических заболеваний печени.

Длительно продолжающееся увеличение активности трансаминаз или повышение в поздние сроки заболевания может означать развитие массивного развитие некроза печени. Высокая активность АсАТ, превышающая активность АлАТ, предполагает обширный некроз и плохой прогноз (это происходит за счет митохондриальной АсАТ).

При рецидивах и обострении активность фермента вновь повышается. Активность АсАТ при этом также повышается, но значительно ниже, чем АлАТ. Коэффициент АсАТ/АлАТ < 1. Умеренное повышение активности фермента наблюдается при циррозе печени, хроническом гепатите. Таким образом, определение активности АлАТ имеет значение:

· Для обследования контактных в очаге инфекции;

· Как индикатор остроты и активности патологического процесса в печени;

· Для диагностики и дифференциальной диагностики заболеваний
печени;

· Критерий полноты выздоровления.

Повышение активности аминотрансфераз можно отметить и у здоровых людей, находящихся на диете, богатой белком или содержащей до 30 % сахарозы.

AсАT в большом количестве находится в клетках сердца и печени. При инфаркте миокарда увеличение активности AсАT в крови наблюдается через 6-8 часов с момента приступа, а спустя 24-36 часов она возрастает в 4-5 раз относительно верхнего предельного уровня диапазона нормальных значений. Снижение активности AсАT до нормальных значений происходит лишь через 3-7 суток. Следует отметить, что повышение активности AсАT в крови наблюдается при формах инфаркта миокарда, которые электрокардиографически выявить невозможно. Сердечная мышца содержит незначительное количество АлАТ. Поэтому уровень активности АлАТ в сыворотке крови при инфаркте миокарда обычно остается в пределах нормы.

Повышение активности AсАT в крови (также как АлАТ) происходит при многих заболеваниях печени. Однако соотношение между увеличением активностей AсАT и АлАТ при разных заболеваниях отличается, поэтому их параллельный анализ дает дополнительную информацию, используемую для постановки точного диагноза.

Снижение активности AсАT и AлАT ниже нормы встречается только при тяжёлых поражениях печени, когда значительно уменьшается количество клеток, синтезирующих эти ферменты (обширный некроз, цирроз).

Существующие методы определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови можно разделить на две основные группы:

1. колориметрические (с остановкой реакции) и метод конечной точки

2. кинетические.

Колориметрический метод Райтмана-Френкеля (основан на образовании пируват-2,4-динитрофенилгидразона), несмотря на присущие ему недостатки, продолжает оставаться распространённым в клинико-диагностической практике. К основным недостаткам данного метода можно отнести:

1. невозможность контроля линейности реакции;

2. накопление в реакции оксалоацетата, ингибирующего аминотрансферазы;

3. необходимость построения калибровочного графика;

4. резкое увеличение адсорбции при высокой активности ферментов, затрудняющее учёт результатов;

5. длительность исполнения анализа и некоторые другие.

Принцип метода:

В результате переаминирования, происходящего под действием АлАТ и АсАТ, образуются ПВК и ЩУК. ЩУК способна в процессе ферментативной реакции превращаться в ПВК. При добавлении 2,4 динитрофенилгидрозина образуется гидразон ПВК. Гидразон ПВК в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся ПВК.

Норма:

АлАТ -0,1 - 0,68 ммоль ПВК \л.ч

АсАТ – 0,1 - 0,45 ммоль ПВК \ л.ч

Кинетические методы. Преимущество кинетического метода состоит в возможности прямого непрерывного спектрофотометрического измерения скорости ферментативной реакции в начальной линейной части кинетической кривой; оксалоацетат удаляется по мере его образования; для расчёта активности ферментов не требуется построения калибровочного графика. Этот современный метод является высокоспецифичным, быстрым и позволяет получать более точные результаты. Во многих странах он является стандартным, референтным способом определения AсАT и АлАТ.

В основе кинетического метода определения активности аминотрансфераз лежит оптический тест Варбурга. Принцип теста основан на разнице поглощения при длине волны 340 нм восстановленной (НАДН) и окисленной (НАД) форм никотинамидаде-ниндинуклеотида. При 340 нм НАДН имеет максимальную адсорбцию, тогда как НАД при данной длине волны не имеет поглощения.

Для определения активностей аминотрансфераз используют сопряженные ферментативные реакции: основная - реакция переаминирования, катализируемая AсАT или АлАТ, и индикаторная - реакция, протекающая под воздействием вспомогательных, индикаторных ферментов, малатдегидрогеназы (МДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

Схема определения активности AсАT:

1. Основная реакция:

АсАТ

L-аспартат + α-кетоглутарат оксалоацетат + L-глутамат

2. Индикаторная реакция

МДГ

оксалоацетат + НАДН L-малат + НАД

Схема определения активности АлАТ:

1. Основная реакция

АлАТ

L-аланин + α-кетоглутарат пируват + L-глутамат

2. Индикаторная реакция

ЛДГ

пируват + НАДН L-малат + НАД

В результате окисления НАДН происходит уменьшение оптической плотности при длине волны 340 нм. Снижение оптической плотности отражает активность AсАT и АлАТ. Для расчета активности ферментов используется коэффициент молярной экстинкции НАДН.