Лабораторного заняття № 2 з дисципліни «Генетична інженерія»

1. Тема заняття: «Механізми реплікації та репарації ДНК»

2. Мета проведення заняття: вивчити механізми репарації та реплікації ДНК.

2.1 Після виконаної роботи студент повинен

знати: Чому модель ДНК Уотсона–Крика відповідає вимогам, що

надаються до носія генетичної інформації, які ферменти беруть участь у синтезі молекули ДНК, чому механізм реплікації має назву напівконсервативний, яка ділянка необхідна для початку синтезу дочірнього комплементарного ланцюгу ДНК

вміти: виявляти особливість функціонування ферменту ДНК-полімерази І та ДНК-полімерази ІІ,

3.План семінарського заняття:

Носій генетичної інформації повинен задовольняти двом основним вимогам: відтворюватися (реплікуватися) з високою точністю і детермінувати (кодувати) синтез білкових молекул. Модель ДНК Уотсона-Крика повністю відповідає цим вимогам. По-перш, згідно з принципом комплементарності, кожен ланцюг ДНК може слугувати матрицею для утворення нового комплементарного ланцюгу. Отже, після одного раунду реплікації утворюються дві дочірні молекули, кожна з яких має таку саму нуклеотидну послідовність, як початкова молекула ДНК. По-друге, нуклеотидна послідовність структурного гену однозначно задає амінокислотну послідовність білку, яку вона кодує.

Синтез ДНК як у прокаріот, так й у еукаріот здійснюється за участю багатьох різних ферментів. Основну роль грає ДНК-полімераза, яка послідовно приєднує нові ланки до ростучого полінуклеотидного ланцюгу за принципом комплементарності і каталізує утворення фосфодіефірних зв’язків.

У бактерій реплікація ДНК починається з особливої точки молекули, яка називається точкою начала (або сайтом ініціації) реплікації (ori, від англ. origin). В ДНК еукаріот існує декілька таких сайтів, і реплікація може починатися в кожному з них. Сегменти еукаріотичної ДНК, що при цьому створюються, зшиваються один з одним за допомогою особливих ферментів.

Крім того, у еукаріот є спеціальний фермент теломераза, який добудовує кінці (теломери) хромосом.

Механізм реплікації був запропонований Дж.Уотсоном і Ф.Криком – авторами теорії подвійного ланцюгу ДНК. Він передбачає розплітання двох ланцюгів ДНК таким чином, щоб кожен з них міг слугувати матрицею для зборки іншого ланцюгу відповідно принципу комплементарності. На матричному, або батьківському ланцюгу поодинокі нуклеотиди вишиковуються певним чином, а їх наступна полімеризація призводить до утворення нового, або дочірнього ланцюгу (репліки), комплементарного першому.

Запропонований механізм реплікації був названий полуконсервативним, оскільки кожна з ідентичних одна до одної дочірніх молекул складається з одного старого і одного нового ланцюгу ДНК.

Як вже відмічалося, для реплікації необхідне локальне розплітання подвійної спіралі в тої області, де ДНК в даний момент слугує матрицею для синтезу дочірніх ланцюгів ДНК. Ця розплетена частина молекули називається реплікативною вилкою.

Реплікація супроводжується пересуванням реплікативної вилки уздовж молекули ДНК і синтезом нових ланцюгів на кожному із старих.

У прокаріот і у еукаріот знайдені, виділені і охарактеризовані 5′→3′ ДНК-полімерази. Дослідження виявили, що під час реплікації бактеріальної ДНК спочатку на деякий час створюються фрагменти довжиною 1000-2000 нуклеотидів. Ці фрагменти отримали ім’я їх першовідкривача – фрагменти Оказаки. При реплікації еукаріотичної ДНК довжина фрагментів Оказаки складає 100-200 нуклеотидів. Було також показано, що синтез фрагментів відбувається в напрямку від 5′ до 3′ кінця, в наступному вони з’єднуються у довгі ланцюги ДНК. Але на одному з ланцюгів нова ДНК синтезується безперервно, а на іншому – фрагментами, що з’єднуються між собою в єдину полімерну молекулу. Перший з ланцюгів називається лідируючий, а інший – відстаючий. Таким чином, на відстаючому ланцюгу синтез відбувається в напрямку 5′→3′, а сам ланцюг росте в напрямку 3′→5′.

Механізм реплікації повинен забезпечувати безпомилкове копіювання матриці. Включення в новий ланцюг ДНК некомплементарних нуклеотидів викликає виникнення мутацій, які можуть спричинити генетичні зміни, що порушують структуру і функції генетичного матеріалу. Наслідки таких мутацій відбиваються негативно, а інколи згубно на життя клітини і всього організму.

Для запобігання помилкового парування ДНК-полімерази володіють здатністю до самокорекції. Коригувальний механізм полягає в тому, що перед приєднанням кожного наступного нуклеотиду до ростучого ланцюгу, ДНК фермент «перевіряє» правильність парування попереднього нуклеотиду.

Якщо нуклеотиди спаровані вірно (відповідно до принципу омплементарності), полімераза приєднує наступний нуклеотид, який згодом також буде перевірений. У випадку помилці парування, «невірний» нуклеотид відщеплюється від ланцюгу ДНК. Потім перевіряється попередній перед вирізаним нуклеотид і так далі. Вирізання нуклеотидів здійснюється завдяки тому, що ДНК-полімераза володіє крім полімеразної ще й 3′→5′-екзонуклеазної активністю. Коли полімераза відщепить неспарений нуклеотид або декілька нуклеотидів і дійде до нормально спарених нуклеотидів, відновлюється її полімеразна активність, й синтез ДНК подовжується до виявлення чергової дефектної пари.

Наявність у ферменту корегувальній здатності визначає, що для ініціації реплікації на матриці йому необхідна хоча б коротка ділянка дволанцюгової ДНК, з якої починається синтез комплементарного ланцюгу.

Така ділянка називається праймером, або запалом.

Для синтезу лідируючого ланцюгу, який триває безперервно, праймер необхідний лише на початку полімеразної реакції. Полімераза, що здійснює синтез відстаючого ланцюгу, потребує праймер перед синтезом кожного фрагменту. Існує спеціальний фермент, що синтезує праймери. Він називається РНК-праймаза і створює короткі РНК-праймери довжиною біля 10 нуклеотидів. Після синтезу фрагментів Оказаки праймер треба видаляти.

Для видалення праймерів і забудови створених проломів починає діяти особлива система репарації (відновлення) ДНК. Основна роль в цьому належить ДНК-полімеразі І Е.соlі і аналогічних ферментів інших організмів.

ДНК-полімеразу І можна розглядати як два ферменти на одному поліпептидному ланцюгу. Перший називається фрагментом Кленова і володіє полімеразної і коригувальної (3′→5′-екзонуклеазної) активністю.

Інший фрагмент здатний відщеплювати нуклеотиди в напрямку 5′→3′, тобто в напрямку синтезу ДНК. Ця 5′→3′-екзонуклеазна активність і надає можливість видаляти праймер.