Молекулярна гібридизація нуклеїнових кислот

Особливості мічення ДНК-олігонуклеотидів. Поняття про ДНК-зонд. Включення мітоку молекулиДНК і РНК in vitro. Характеристика радіоактивних (32Р, 33Р, 35S, 3Н) та нерадіоактивних (біотинова, диоксигенінова, флюоресцентна) міток нуклеїнових кислот та способи їхньої детекції. Вимоги до матриць, що використовуються у реакціях мічення.

Включення міток у ДНК за допомогою методу нік-трансляції та методу випадкових гексануклеотидних праймерів. Мічення 3’-кінців ДНК за допомогою ДНК-полімераз та термінальної трансферази. Дефосфорилювання ДНК лужною фосфатазою. Включення 5’- кінцевої мітки за допомогою полінуклеотидкінази.

Використання ПЛР для мічення ДНК. Мічення ДНК за допомогою транскрипції in vitro. Мічення к-ДНК за допомогою зворотної транскрипції.

Гібридизація нуклеїнових кислот in situ. Блот-гібридизація нуклеїнових кислот. Поняття про блоттинг. Електроблотинг. Фіксація нуклеїнових кислот на фільтрах. Методи гібридизації нуклеїнових кислот: гібридизація за Саузерном, Нозерн-блоттинг, Вестерн-блоттинг, дот- та слот- гібридизація (етапи проведення та розрішальна здатність). Гібридизація з використанням колоній, утворених мікроорганізмами та бляшок, утворених вірусами. Методи детекції та оцінки гібридизаційних сигналів. Хемілюмінесцентна та колориметрична детекція гібридизації. Аналіз результатів ДНК-РНК та ДНК-ДНК –гібридизації.

Напрямки використання методів гібридизації нуклеїнових кислот (ідентифікація генів та вивчення їх експресії, діагностика спадкових захворювань та інфекційних агентів, визначення спадкового поліморфізму, проведення таксономічних досліджень та геномної дактилоскопії тощо).

Створення і використання ДНК-мікрочіпів.

Основні недоліки метода блот-гібридизації.