Лекция 6. Вирусы европейской и африканской чумы свиней. Вирус парвовирусной инфекции свиней

Классическая чума свиней - инфекционная болезнь, характеризующаяся поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтеритическим воспалением толстого кишечника. В зависимости от вирулентности вируса, а также иммунного статуса организма классическая чума свиней может протекать в сверхострой, острой, подострой и хронической формах.

Сверхострое течение, типичное только для молодых животных, характеризуется быстрым течением, высокой лихорадкой и быстрой гибелью. Острое течение, проявляющееся обычно в начале эпизоотии, характеризуется лихорадкой, угнетением, поносами, рвотой, слизисто-гнойным ринитом, появлением пустул на коже, супоросные свиноматки абортируют. Классическая чума свиней в хронической форме протекает как сочетанная вирусно-бактериальная инфекция. В этом случае в патологический процесс обычно вовлекаются сальмонеллы (кишечная форма чумы, характеризующаяся крупозно-дифтеритическим тифлоколитом) или пастереллы (легочная форма с гнойно-фибринозным воспалением легких).

Кроме клинически выраженной формы чумы болезнь может протекать субклинически, что наблюдается в случае внутриутробного заражения поросят, что происходит в случае размножения вирулентных штаммов вируса в организме свиноматок, привитых инактивированными вакцинами. Рождающиеся от таких свиней поросята отстают в росте, постоянно выделяют вирус во внешнюю среду или гибнут в возрасте 3-8 недель. Возможна длительная персистенция вируса в организме поросят, зараженных трансплацентарно от хронически больных свиноматок, что способствует появлению стационарных очагов чумы свиней.

Возбудителем классической чумы свиней является вирус из семейства Flaviviridae, рода Pestivirus. Это РНК-содержащий вирус, в геном которого входит единая односпиральная молекула РНК. В антигенном отношении возбудитель классической чумы свиней однороден. В этой связи для производства живых вакцин против чумы используют аттенуированный штамм К, репродуцированный в организме кроликов (вакцина АСВ), культуре клеток почки эмбриона свиней (ВГНКИ) или тестикулов ягнят (ЛК-ВНИИВВВиМ)

В отличие от антигенной структуры, возбудитель классической чумы свиней значительно различается по вирулентности, что дало возможность выделить его три группы. В группу А входят вирулентные эпизоотические штаммы, вызывающие у свиней остро протекающую инфекцию. Штаммы вируса, принадлежащие группе В, вирулентны только для поросят и вызывают атипичную и хроническую формы болезни. К группе С относят только один слабовирулентный штамм, выделенный в Америке и обозначенный как штамм 331. Клеткой-мишенью для вируса КЧС являются лейкоциты и эндотелиальные клетки. В связи с тем, что данные типы клеток присутствуют во многих органах и тканях организма (главным образом в лимфоузлах, костном мозге, слизистой оболочке пищеварительной и дыхательной систем, кровеносных сосудах), вирус классической чумы свиней является пантропным. Заражение животных происходит главным образом per os, вирусовыделение с мочой, фекалиями, истечениями из носа начинается в инкубационном периоде.

Культивирование вируса проводят на различных линиях культур клеток, наиболее приемлемой из которых является линия РК-15 (перевиваемая культура почки поросенка). При культивировании в культурах клеток развитие выраженного ЦПД обнаружить не удается - индикацию вируса и его титрование проводят с помощью метода иммунофлуоресценции. Эта реакция позволяет также проводить дифференциацию вакционного и эпизоотического штамма – последние выявляются в РИФ уже через 24 часа после заражения

Отбор патматериала осуществляют в первые 2 часа после гибели или убоя больного животного. Материал в виде проб крови, кусочков селезенки, миндалин, лимфоузлов, грудной кости, почек и легких помещают в стерильные флаконы и закрывают резиновыми пробками. Емкости с патматериалом снаружи обрабатывают дезинфектантами (5% хлорамин или 20% раствор хлорной извести), обертывают марлей, смоченной дезинфицирующим раствором, и укладывают в полиэтиленовый пакет. В лабораторию материал доставляют в замороженном виде. В сопроводительном документе указывают клиническое проявление болезни, дату последней вакцинации и название вакцины.

Подготовка материала включает приготовление на 0,85%-ном растворе натрия хлорида 20%-ной суспензии, которую трижды замораживают и оттаивают, после чего центрифугируют при 3-4 тыс об/мин в течение 20-30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками при 37˚С в течение одного часа для выделения вируса на культурах клеток либо не менее 4 часов при 4˚С в случае дальнейшей постановки биопробы на свиньях. Кроме приготовления суспензии, параллельно готовят замороженные гистосрезы из лимфоузлов, селезенки, почек и миндалин, а из проб костного мозга и лейкоцитарного концентрата – мазки. Последний готовят путем отстаивания в течение 1 часа стабилизированной крови и центрифугирования образовавшейся в верхнем слое после отстаивания плазмы. Образующийся беловатый осадок представляет собой лейкоциты.

Лабораторная диагностика классической чумы свиней включает:

- обнаружение вируса в первичном материале с последующим его выделением на культурах клеток;

- постановка биопробы на поросятах;

- обнаружение специфических антител в сыворотках крови свиней.

Первичное обнаружение вируса в патматериале производится путем постановки РИФ, в которой исследуют мазки из костного мозга или лейкоцитов, реже – гистосрезы. При этом зафиксированный препарат обрабатывают флуоресцирующим конъюгатом в смеси с красителем Эванса (3:1). Специфическое зеленое свечение в цитоплазме даже в отдельных клетках препарата на красно-оранжевом фоне дает право на постановку предварительного диагноза.

Выделение вируса осуществляют путем заражения перевиваемой культуры клеток РК-15, выращенной на стеклянной пластине. Вирус классической чумы свиней в культурах клеток ЦПД не вызывает, поэтому индикацию вируса проводят методом иммунофлуоресценции через 24-96 ч инкубации клеточного монослоя. При совпадении результатов РИФ при исследовании патматериала и культуры клеток можно ставить окончательный диагноз.

Биопроба при диагностике классической чумы свиней заключается в подкожном заражении поросят 2-3-месячного возраста суспензией патматериала в количестве 2 мл. При этом проводят одновременное заражение неимунных поросят и поросят, предварительно привитых против классической чумы свиней (по три поросенка). Положительный результат биопробы характеризуется развитием клинически выраженной формы болезни у двух или трех неимунных поросят и отсутствием клинического проявления болезни у иммунизированных животных. В этом случае ставят окончательный диагноз на классическую чуму свиней.

Для выявления специфических антител в сыворотке крови свиней используют РНГА, РДСК, РНИФ, ИФА. Реакцию непрямой гемагглютинации используют для оценки противовирусного иммунитета, при этом титры выше 1:32 указывают на напряженный иммунитет. Дифференциацию постинфекционных и поствакцинальных антител проводят в реакции непрямой иммунофлуоресценции в культуре клеток РК-15.

Африканская чума свиней -острая, высоко контагиозная болезнь, характеризующаяся явлениями острого токсикоза, некробиозом клеток лимфоидной ткани, появлением в органах тромбозов, кровоизлияний и заканчивающаяся почти всегда смертельно. Клиническая картина, а также длительность течения при африканской чуме свиней аналогична классической чуме свиней. Однако в патологический процесс в большей степени вовлечена дыхательная система, чем пищеварительная, и, кроме того, воспаление внутренних органов носит ярко выраженный геморрагический характер. Хроническое течение характеризуется длительным персистированием вируса внутри организма свиней. Гибель при хронической форме болезни наступает после вовлечения в инфекционный процесс легких. Латентное течение характерно для естественных носителей вируса – диких свиней, которые являются пожизненными выделителями вируса во внешнюю среду. Особенностью эпизоотического процесса при африканской чуме свиней является постоянное присутствие резервуара возбудителя – отдельных видов клещей, в организме которых вирус длительно сохраняется и даже размножается. Инфицирование вирусом клещей, а также передача его здоровым свиньям происходит в процессе кровососания. Присутствие резервуара возбудителя инфекции в эпизоотическом процессе обусловливает длительную стационарность эпизоотических очагов и постоянное сохранение возбудителя в природе.

Возбудителем африканской чумы свиней является вирус из семейства Asfarviridae, рода Asfarvirus. Данный род включает исключительно возбудителя африканской чумы свиней. Это ДНК-геномный вирус, репродукция которого происходит в цитоплазме с образованием специфических паракристаллических телец-включений в конце инфекционного цикла.

Вирус реплицируется в макрофагах, а также может содержаться в высоких титрах в эритроцитах свиней. У вируса сложная антигенная структура: он содержит комплементсвязывающий, преципитирующий и гемадсорбирующий антигены. При этом белки первых двух антигенов не подвержены изменчивости и являются схожими у всех штаммов вируса, изолируемых от свиней в различных географических местах. В этой связи реакциями связывания комплемента и иммунодиффузии выявляют антитела, общие для всех вирусов африканской чумы свиней.

Поверхностные суперкапсидные белки, отвечающие за феномен гемадсорбции на поверхности инфицированной культуры клеток, отличаются значительной вариабельностью, то есть гемадсорбирующий антиген у вируса является типоспецифическим. По результатам РТГАд выделено три антигенные группы, обозначенные как А, В и С, причем в пределах этих групп выявлено большое число серотипов. В редких случаях изолируют отдельные штаммы вируса, не обладающие гемадсорбирующими свойствами даже после длительной адаптации их на культуре клеток. Установлена прямая корреляция между активностью специфической гемадсорбции и вирулентностью вируса африканской чумы, а также между титром вируса в исследуемом материале и временем появления гемадсорбции на поверхности инфицированной культуры клеток.

Особенностью вируса африканской чумы свиней является его неоднородность даже в пределах одной популяции. Он представляет собой гетерогенную популяцию, состоящую из клонов, отличающихся по признакам гемадсорбции, вирулентности, инфекционности, антигенным свойствам, причем изменение отдельных биологических характеристик может наступать даже в ходе одного цикла культивирования in vitro. В этой связи при оценке эпизоотического штамма, изолируемого от свиней в ходе одной эпизоотической вспышки, принимают во внимание характеристики доминирующего в популяции клона с наибольшей вирулентностью.

Лабораторная диагностика. Основанием для подозрения африканской чумы свиней может служить возникновение заболевания с быстрым течением и высокой смертностью среди свинопоголовья, привитого против классической чумы свиней. В лабораторной диагностике африканской чумы свиней главным является дифференциация болезни против классической чумы свиней.

Отбор патматериала проводят от погибших или вынужденно убитых животных. Обязательным материалом для взятия являются пробы крови и селезенки, так как нахождение вируса в этих тканях является постоянным при всех формах болезни. В лабораторию также направляют ткани сердца, легких, печени, почек, миндалин и лимфоузлов. Пробы берут кусочками массой 10-15 г и помещают во флаконы, которые затем заключают в термос с охлаждающей жидкостью.

Подготовка материала заключается в приготовлении 20%-ной суспензии из проб внутренних органов на физиологическом растворе или растворе Хенкса. После этого суспензию центрифугируют при 1-2 тыс об/мин, к надосадочной жидкости добавляют антибиотики (по 500 ЕД/мл) пенициллина и стрептомицина, выдерживают 2 часа при комнатной температуре и используют для заражения культур клеток. Пробы крови дефибринируют. Из проб внутренних органов готовят мазки-отпечатки для исследования в РИФ.

Лабораторную диагностику африканской чумы свиней проводят по следующим направлениям:

- обнаружение вируса в патматериале с подтверждением диагноза путем выделения вируса на культуре клеток и его идентификацией;

- постановки биопробы на подсвинках;

- обнаружение специфических антител в сыворотке крови.

Первичное обнаружение вируса в патматериале производится путем постановки РИФ. Обязательным в реакции является постановка отрицательного контроля с использованием иммунных сывороток против классической чумы свиней. Специфическое свечение наблюдается в виде отдельных гранул, диффузного скопления или включений. В препаратах из лимфоузлов и селезенки антиген содержится в цитоплазме лимфоидных клеток в форме отдельных зеленых гранул, гомогенных желтовато-зеленых округлых или бобовидных включений, а также в виде диффузного зеленого свечения всей цитоплазмы.

Первичное обнаружение вируса можно также проводить путем постановки РСК и РИД. В качестве антигена используют надосадочную жидкость, образующуюся после центрифугирования суспензии из внутренних органов. Для ее получения проводят экстрагирование суспензии из внутренних органов смесью ацетона и эфира. Однако удовлетворительные результаты реакции получают только при диагностике острого течения болезни - при хроническом и латентном течениях количества антигена оказывается недостаточным и, кроме того, в патматериале часто присутствуют антитела, препятствующие правильной постановке реакции.

Выделение вируса осуществляют на культурах клеток лейкоцитов или костного мозга свиней. Материалом для заражения служит дефибринированная кровь или суспензия из внутренних органов, из которых готовят десятикратные разведения материала (от 10^-1 до 10^-4). Для культивирования отбирают 2-4-суточные культуры лейкоцитов без признаков дегенерации. Заражение производят в 4 пробирки из каждой пробы по 0,2 мл материала без удаления из пробирок с монослоем культуральной жидкости.

Культивирование вируса африканской чумы свиней в культурах клеток производят в течение 8-10 дней до появления гемадсорбции и ярко выраженного ЦПД. При этом в гемадсорбции участвуют эритроциты, вносимые в культуры клеток вместе с инфекционным патматериалом.

При нахождении в исследуемом материале вируса африканской чумы свиней отмечают адсорбцию эритроцитов на поверхности клеток в виде ягоды малины. Обычно отчетливая гемадсорбция наблюдается через 30-48 часов после заражения. В дальнейшем пораженные вирусом клетки лизируются и отделяются от стекла, что следует считать проявлением ЦПД вируса. При низких концентрациях вируса в патматериале появление гемадсорбции и ЦПД отмечается в более поздние сроки. Реакция считается положительной, если в инфицированных культурах лейкоцитов гемадсорбция отчетливо проявляется на 2-5-е сутки после заражения с последующим ЦПД на 3-7-е сутки. Если изменения в культуре клеток в указанные сроки отсутствуют, то учет проводят в течение 8-10 дней, а затем делают не менее 3 слепых пассажей.

Идентификацию вируса проводят в РИФ, а также путем обнаружения телец-включений в цитоплазме пораженных клеток. Цитологическое исследование основано на обнаружении вакуолей в цитоплазме и ацидофильных включений, которые выявляются после окрашивания по Гимзе. Рекомендуется параллельно с окраской по Гимзе обрабатывать инфицированный монослой акридин оранжевым для подтверждения присутствия ДНК-геномного вируса в культуре клеток.

Биопроба заключается во внутримышечном заражении восьми подсвинков 2-4-месячного возраста, иммунных к классической чуме свиней. При этом проводят параллельное заражение четырех из них исследуемым материалом, а других четырех – вирусом классической чумы свиней. Гибель животных, зараженных исследуемым материалом, и отсутствие клинических признаков в контроле свидетельствует о наличии вируса африканской чумы свиней. Отсутствие клинического проявления у всех восьми подсвинков свидетельствует о наличии вируса классической чумы свиней в патматериале.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика имеет большое эпизоотологическое значение в виду длительной персистенции вируса в организме свиней без клинического проявления. Кроме того, по индикации антител можно судить о количестве хронических и субклинических случаев болезни. Основной серологической реакцией является НРИФ, в которой в качестве антигена используют монослой, полученный из лейкоцитов свиней и зараженный вирусом африканской чумы свиней. Также аналогичная задача может быть выполнена РТГАд, РСК и РРИД.

Парвовирусная инфекция свиней -контагиозная вирусная болезнь, проявляющаяся клинически только у супоросных свиноматок и характеризующаяся прохолостами, малочисленными пометами, рождением мумифицированных плодов, мертвых и слабых поросят и реже абортами.

Заражение животных происходит пероральным или аэрогенным путем, после чего вирус в течение недели присутствует в крови (виремия), что сопровождается незначительной лейкопенией и кратковременным повышением температуры. В период виремии вирус проходит через плаценту и инфицирует эмбрионы и плоды. В случае инфицирования эмбрионов в раннюю стадию супоросности (до 36 дней) они погибают и рассасываются. У зараженных на 36-56-й день супоросности часть или реже все плоды погибают и мумифицируются; мертворождение происходит при инфицировании свиноматок на 56-70-й дни супоросности. После 70—го дня супоросности плоды в большинстве случаев становятся устойчивыми к патогенному действию вируса, но после рождения являются носителями одновременно вируса и антител. У небеременных свиноматок и хряков-производителей вирус не вызывает патологических изменений в организме. Остается мало выясненным патогенное действие парвовируса свиней на организм поросят. В последнее время вирус выделен из содержимого тонкого кишечника поросят 2-3-недельного возраста с диарейным синдромом и везикулярными поражениями.

Возбудителем парвовирусной инфекции свиней является вирус из семейства Parvoviridae, рода Parvovirus. Данный вирус вызывает у свиней болезнь репродуктивных органов, иначе называемую болезнью СМЕДИ (сокращение от синдрома, проявляющегося мертворождением, мумификацией, смертью эмбрионов, бесплодием). Как было установлено, клинически схожее синдрому СМЕДИ заболевание может также вызываться вирусами других родов, в частности энтеровирусами пяти типов. В настоящее время возбудителем синдрома СМЕДИ признан только парвовирус свиней Parvovirus suis. Это ДНК-содержащий вирус, геном которого представлен однонитевой молекулой ДНК. Вирус содержит три структурных полипептида молекулярной массы 83, 64 и 60 кД, обозначаемых как А, В и С. Различные штаммы парвовирусов свиней сходны по антигенной структуре и не имеют антигенного родства с парвовирусами других животных за исключением парвовируса собак, между которыми имеются слабо выраженные антигенные связи. Простое строение вириона обусловливает высокую устойчивость возбудителя во внешней среде, в частности способны выдерживать воздействие температуры 70°С, а также действие различных сред в диапазоне рН от 3,0 до 9,0.

Вирус является патогенным только для свиней. В лабораторных условиях вирус культивируют в первичных и перевиваемых культурах клеток. В любом случае вирус нуждается в наличии интенсивно размножающихся клеток, так как для его репликации требуется фермент ДНК-полимераза, содержащийся в высоко активном состоянии в S- фазе клеточного цикла. В этой связи заражение культур клеток целесообразно проводить в период их логарифмического роста, когда сформировалось только 30-50% монослоя. Из первичных культур клеток рекомендуется использование культур клеток почек (РК-15) и тестикул (ST) поросят. Перевиваемые культуры клеток человека (HeLa, Hep-2, KB, FL-Amnion) признаны контаминированными парвовирусами свиней. Размножение парвовируса свиней в первичных и перевиваемых культурах клеток сопровождается развитием цитопатического эффекта, который характеризуется диффузной зернистостью и округлением клеток, отделением их от стекла и частичным или полным разрушением клеточного монослоя.

Учитывая высокую вероятность спонтанной контаминации используемых в лабораториях культур клеток, рекомендуется проводить их деконтаминацию путем серийного пассирования их в присутствии специфической сыворотки (1%) в ростовой среде. Перед использованием культуры рекомендуется исследовать с целью исключения парвовирусной контаминации по РГА и гемадсорбции эритроцитов морских свинок.

Парвовирус агглютинирует эритроциты морской свинки, цыплят, крыс, мышей и некоторых других животных и не агглютинирует эритроциты барана, лошадей, свиней, крупного рогатого скота. Для постановки реакций чаще используют эритроциты морской свинки, реакцию проводят при температуре 4°С, в качестве разбавителя используют фосфатно-буферный раствор.

Лабораторная диагностика. На наличие в хозяйстве парвовирусной инфекции могут указывать признаки нарушения воспроизводительной способности свиноматок, однако окончательный диагноз ставят на основании результатов лабораторного исследования.

Постановка диагноза на парвовирусную инфекцию свиней путем выделения вируса из патматериала является малопригодным диагностическим тестом, так как выделить возбудитель из погибших и мумифицированных плодов удается не всегда. Кроме того, используемые для изоляции вируса культуры клеток зачастую бывают изначально контаминированными парвовирусами, что может приводить к диагностическим ошибкам.

Лабораторная диагностика парвовирусной инфекции свиней проводится по следующим направлениям:

- индикация и идентификация возбудителя непосредственно в патматериале путем постановки РГА и РИФ;

- обнаружение специфических антител в сыворотке крови больных животных.

Отбор патматериала. На исследование направляют мумифицированные плоды не позднее 70 дней супоросности (длиной менее 16 см) или легкие от них. Инфицированные плоды позднее 70 дней супоросности обычно содержат вместе с антигенами антитела, что мешает выявлению вируса и вирусного антигена.

Для серологического исследования в лабораторию направляют 10-15 проб сывороток крови (по 2-3 мл) от свиноматок с нарушением воспроизводительной функции. Также рекомендуется направлять сыворотку крови от плодов, мертворожденных и новорожденных поросят до приема молозива. Вместе с сывороткой крови от плодов в лабораторию возможно доставлять жидкость из анатомических полостей после хранения их при температуре 4°С в течение ночи. Материал доставляют в термосе со льдом.

Подготовка материала заключается в приготовлении препаратов-отпечатков из внутренних органов и обязательно легких плода, так как вирус содержится в тканях только при отсутствии антител, а в присутствии антител – сохраняется в легких. Параллельно с приготовлением препаратов-отпечатков из тканей плода готовят 20-30%-ную суспензию, центрифугируют при 1 тыс об/мин в течение 20 минут, после чего надосадочную жидкость используют в качестве антигена для постановки РГА.

Индикацию и идентификацию вируса проводят в РГА и РИФ. Для постановки реакции гемагглютинации используют 0,6%-ную взвесь эритроцитов морской свинки на фосфатном буфере. Реакцию проводят при температуре 4°С с ее учетом после 60 минут инкубации.

В реакции иммунофлуоресценции исследуют препараты-отпечатки из внутренних органов абортированных плодов. При совпадении результатов диагностической индикации (в РГА) и серологической идентификации вируса (в РИФ) ставят окончательный диагноз.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика основана на выявлении специфических антител в сыворотке крови свиноматок и плодов. С этой целью осуществляют постановку РТГА с использованием диагностического набора ВИЭВ и ВГНКИ. Сыворотки от свиноматок и плодов исследуют в реакции в разведениях от 1:8 до 1:16384, которые смешивают с 4 ГАЕ антигена и после часового контакта при комнатной температуре к смеси добавляют 0,6%-ную суспензию эритроцитов морской свинки. Результат реакции учитывают через 2-3 часа инкубации при 4°С.

Диагноз считают установленным в случае обнаружения в двух и более из числа доставленных для исследования пробах специфических антител в разведениях 1:64 и выше. Для серодиагностики болезни можно использовать реакцию микронейтрализации в пластиковых панелях с круглодонными лунками, РИД и ELISA- вариант ИФА.