Лекция 3. Вирусы диареи, аденовирусной инфекции крупного рогатого скота

Вирусная диарея – инфекционная болезнь крупного рогатого скота, преимущественно молодых животных (2 мес. – 2 года), характеризующаяся эрозивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта, ринитом, высокой лихорадкой, лейкопенией, постоянной диареей, эрозивно-язвенным стоматитом, у коров возможны аборты.

Возбудителем вирусной диареи крупного рогатого скота является вирус семейства Flaviviridae, рода Pestivirus. Кроме возбудителя вирусной диареи крупного рогатого скота данный род включает возбудителей классической чумы свиней и пограничной болезни овец. В пределах рода пестивирусы связаны общностью антигенной структуры, поэтому антитела против вируса классической чумы свиней способны нейтрализовать вирус диареи. Вирусу диареи характерен тропизм к клеткам слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, а также способность длительно сохраняться и реплицироваться в иммунокомпетентных клетках, что оказывает значительное иммунодепрессивное действие в патогенезе болезни. Подавление гуморальных механизмов иммунитета и защиты приводит к активизации присутствующих в организме микроорганизмов и вирусов, в частности герпесвирусов (чаще вируса ИРТ). Кроме того, это свойство вируса вызывает исчезновение вирусоспецифических антител в крови животных хронически больных вирусной диареей.

Разные штаммы вируса диареи различаются по вирулентности, тропизму, но идентичны в антигенном отношении, то есть наличие серовариантов возбудителя не установлено.

Кроме различий по вирулентности и тропизму установлено наличие двух типов вируса диареи, отличающихся по цитопатогенному действию: одни вызывают образование ЦПД на культурах клеток (цитопатогенные штаммы), другие – не обладающие цитопатогенностью. Последние чаще имеют в организме тропизм к клеткам иммунной системы и вызывают латентную персистирующую инфекцию без формирования антител. Предполагают, что для проявления клинически выраженной формы болезни необходимо первоначальное заражение животного нецитопатогенным штаммом с последующим инфицированием вирулентным цитопатогенным штаммом вируса.

Лабораторная диагностика. В лабораторию направляют патматериал от больных животных, взятый в первые 2-3 дня болезни при выраженных симптомах болезни, или от животных, убитых с диагностической целью в период острой стадии болезни. От больных животных берут 15-20 проб материала: смывы со слизистой оболочки носовой полости, соскобы с изъязвленных или эрозивных участков слизистой оболочки ротовой полости и носового зеркала, взятые жестким ватно-марлевым тампоном или скальпелем. Тампоны помещают в стерильные пенициллиновые флаконы или пробирки с 2-3 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса, содержащего 500-1000 ЕД/мл антибиотиков. От убитых животных отбирают кусочки легких с бронхом, селезенки, обязательно лимфоузлы, пораженный участок желудочно-кишечного тракта. Учитывая тропизм вируса диареи к иммунокомпетентным клеткам крови, в лабораторию также направляют пробы крови. Для этого в начале болезни в период подъема температуры от больных животных берут пробы крови, которые смешивают с раствором цитрата натрия или гепарина и помещают в термос со льдом.

Лабораторную диагностику вирусной диареи проводят по следующим направлениям:

- первичное обнаружение вируса в патматериале реакцией иммунофлуоресценции;

- изоляция вируса на культурах клеток с его идентификацией;

- обнаружение специфических антител в крови животных (ретроспективная серодиагностика).

Обнаружение вируса в патматериале осуществляют в РИФ. Для этого исследуют препараты-отпечатки из патматериала, а при жизни животного – биопсийный материал слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, а также носоглоточные смывы. При исследовании обращают внимание на свечение антигена в цитоплазме неразрушенных клеток. Яркая зеленая флуоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз на болезнь ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего числа исследованных проб.

Выделение вируса осуществляют на первичных и субкультурах клеток эмбриона крупного рогатого скота (ПЭК, ЛЭК, СЭК) или ТБ. При выделении вируса диареи следует иметь в виду существование цитопатогенных и нецитопатогенных штаммов вируса - первые способны вызвать развитие ЦПД в виде появления мелкозернистой инфильтрации в клетках с последующим их отторжением от стекла. Причем к концу культивирования остается только сеть зернистого материала.

Идентификацию вируса диареи проводят в РИФ, однако основным методом идентификации является РН.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Диагноз на прошедшую инфекцию, а также латентное вирусоносительство ставят при помощи РН в культурах клеток, определяя титры антител в сыворотках крови животных. При этом исследуют пробы сывороток как при однократном, так и при двукратном взятии. Для диагностики скрытого течения инфекции чаще исследуют сыворотку крови убойного скота, поступающего с клиникой поражения кишечного и респираторного трактов невыясненной этиологии. Исследуемую сыворотку в реакции используют в разведениях от 1:2 до 1:32. Положительными считают сыворотки с титром антител в РН 1:16 и выше, в парных пробах – с повышением титра антител в 4 и более раз во второй пробе.

Кроме РН, возможно использование РСК, которую ставят микрометодом в микротитраторе Такачи, а также пробирочным методом. Положительной считается реакция с полной задержкой гемолиза в ряду с исследуемой сывороткой в разведении 1:2 и выше. При частичной задержке гемолиза в этом разведении реакция считается сомнительной, и проводят повторное исследование. Вторично полученный сомнительный результат считают отрицательным.

Аденовирусная инфекция – остро протекающая болезнь молодняка крупного рогатого скота, характеризующаяся поражением органов дыхания и пищеварения, конъюнктивитами. К болезни восприимчив молодняк с 2- недельного возраста до 4-х месяцев, животные старшего возраста являются вирусоносителями.

Возбудителем аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота является ДНК-геномный вирус из семейства Adenovirus, род Mastadenovirus. В семействе также имеется род Aviadenovirus, вызывающий аденовирусную инфекцию у птиц. Возбудитель аденовирусной инфекции крупного рогатого скота содержит белки, некоторые из них обладают антигенными свойствами и стимулируют выработку антител, выявляемых в различных серологических реакциях. Наибольшее значение имеют белки трех типов: А, В и С. Антиген А присутствует во всех штаммах аденовирусов, причем различают его два иммунологических подтипа. Функционально они являются комплементсвязывающими и преципитирующими антителами и могут быть выявлены в РСК и РИД. Наличие двух разновидностей антигена А дало возможность разделить все штаммы на две антигенные подгруппы, обозначаемые как подгруппы I и II. Антиген В является токсическим фактором, ответственным за ранний цитопатический эффект.

Антиген С является типоспецифическим и выявляется в РН и РТГА. Выделяют 10 разновидностей антигена С, что позволило разделить все штаммы аденовирусов на 10 серотипов. Установлено, что серотипы 1,2 и 3 имеют общий комплементсвязывающий антиген А, поэтому они объединены в первую (I) антигенную подгруппу. Все остальные штаммы содержат комплементсвязывающий антиген второго типа, поэтому они объединены во вторую серологическую подгруппу.

В ветеринарной практике типизацию выделенных аденовирусов проводят чаще по РСК, поэтому ограничиваются установлением принадлежности выделенного аденовируса к одной из подгрупп (I и II). Более подробную типизацию (по 10 серотипам) в РН и РТГА проводят реже.

Аденовирусов крупного рогатого скота не способны инфицировать лабораторных животных и РКЭ, поэтому тканевые культуры являются единственной биологической системой для культивирования вируса. В ходе репродукции аденовирусы вызывают развитие в них ЦПД и образование внутриядерных включений. При этом аденовирусы первой подгруппы (серовары 1, 2 и 3) индуцируют образование одного внутриядерного включения неправильной формы на культурах клеток ПЭК, ЛЭК и ТБ. Аденовирусы второй подгруппы продуцируют большое число внутриядерных включений в одной клетке правильной округлой формы, однако они более требовательны к культурам клеток (медленно репродуцируются в культурах клеток ТБ и не размножаются в ПЭК). Гемагглютинирующие свойства аденовирусов КРС неодинаковы, поэтому использование РТГА в ветеринарной практике весьма ограничено. Аденовирусы обладают онкогенными свойствами и способны при введении вызывать образование опухолей у лабораторных животных.

Лабораторная диагностика. Решающее значение в постановке диагноза на аденовирусную инфекцию имеет лабораторное исследование, так как сходную патологию могут вызвать вирусы других таксономических групп: парагрипп-3, диареи, респираторно-синцитиальной инфекции и др.

Отбор патматериала производится аналогично, как и при парагриппе-3.

Подготовка материала по общепринятой методике и включает центрифугирование жидкого материала при 1000 об/мин в течение 10-15 минут. В дальнейшем надосадочную жидкость используют для выделения вируса на культурах клеток, а осадок - для приготовления мазков с целью индикации вирусного антигена в РИФ. Для этого к осадку добавляют 0,5мл физиологического раствора и делают 12 мазков на предметном стекле из каждой пробы.

Из патматериала (кусочки органов) также готовят препараты-отпечатки или гистосрезы для иммунофлуоресценции, а затем после измельчения приготавливают 10%-ную суспензию для заражения культур клеток. Полученные мазки, отпечатки, срезы подсушивают в струе воздуха вентилятора, фиксируют в охлажденном ацетоне 20-30 минут и обрабатывают флуоресцирующими сыворотками против I и II подгрупп аденовирусов в течение 45 минут при 37ºС. После трехкратного промывания препаратов в физиологическом растворе его микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Яркая зеленая флуоресценция в виде гранул различной формы и величины в ядре и цитоплазме не менее чем 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб.

Выделение вируса. Аденовирусы изолируют на первично-трипсинизированных или субкультурах клеток эмбрионов крупного рогатого скота (почки, легкие, селезенка) или ТБ. Каждой пробой материала инокулируют не менее 4 пробирок с монослоем. Наблюдение за зараженными культурами клеток проводят в течение 7-14 суток, ежедневно просматривая монослой под малым увеличением микроскопа для выявления ЦПД, которое характеризуется дегенерацией монослоя в виде разбухания клеток, их округления и собирания в конгломераты, похожие на гроздья винограда. Изолят считается выделенным в случае появления однотипного ЦПД не менее чем в 3 последовательных пассажах. В случае обнаружения характерного ЦПД проводят заражение монослойной культуры клеток, выращенной на покровных стеклах для последующей идентификации вируса в РИФ. Постановку РИФ осуществляют по вышеописанной методике исследования препаратов-отпечатков.

Идентификацию вируса осуществляют в РСК или РИД. При этом в реакциях обязательно используют два типа сывороток из-за различия комплементсвязывающих и преципитирующих антигенов аденовирусов I и II подгрупп. Постановку РСК проводят по общепринятой методике, по результатам которой идентифицируют аденовирус и устанавливают его принадлежность к одной из подгрупп.

Реакция связывания комплемента также позволяет обнаруживать и идентифицировать полевые штаммы аденовирусов непосредственно в патматериале. Однако отрицательный результат РСК при обнаружении вируса в материале не дает основания для общего отрицательного результата исследования.

Идентификацию вируса также проводят в РИД, однако штаммы аденовирусов, принадлежащих II серогруппе, проявляют низкую активность в реакции с гомологичными сыворотками и дают ложно отрицательный результат. В качестве испытуемого антигена в реакциях (РСК и РИД) используют культуральную вируссодержащую жидкость, которую дополнительно концентрируют центрифугированием.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. При положительном результате выделения и идентификации вируса для окончательной постановки диагноза необходимо провести исследование парных проб сывороток крови больного животного, от которого вирусологическим методом был изолирован аденовирус. Отбор парных проб сывороток крови проводят по общепринятой методике, которые исследуют в РСК или РИД, реже – в РНГА. Диагностическое значение имеет 4- кратное и более нарастание титра антител во второй пробе.