Подходы к культивированию. Изучение культур микроорганизмов

Практикум 5. Особенности механизмов питания и метаболизма у бактерий.

Подходы к культивированию. Изучение культур микроорганизмов.

Метаболизм (обмен веществ) бактерий представляет собой совокупность 2 взаимосвязанных противоположных процессов: катаболизма и анаболизма.

Катаболизм (диссимиляция) — распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ.

Анаболизм (ассимиляция) — синтез веществ с затратой энергии (расходованием АТФ).

Особенности метаболизма бактерий:

1) многообразие используемых субстратов

2) интенсивность процессов метаболизма

3) направленность всех процессов метаболизма на обеспечение процессов размножения

4) преобладание процессов распада над процессами синтеза

5) наличие экзо– и эндоферментов метаболизма

Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты (использовать) за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства.

По месту действия выделяют:

1) экзоферменты- действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий;

2) эндоферменты- действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ.

Белковый обмен у бактерий – это, с одной стороны, – процесс синтеза собственных аминокислот и белков путем ассимиляции необходимых компонентов из внешней среды, а с другой, – внеклеточное расщепление белков под воздействием различных ферментов. При наличии у бактерий протеаз белки расщепляются ими до промежуточных продуктов распада — пептонов. При наличии пептидаз пептоны расщепляются ими до аминокислот и продуктов их распада - аммиака, сероводорода, индола.Данные продукты используют как индикаторы при идентификации микроорганизмов. Бактериальные клетки удовлетворяют свои потребности в аминокислотах двумя путями: одни микроорганизмы получают аминокислоты при расщеплении белка, другие синтезируют их из простых соединений азота. Важным свойством микробов является способность синтезировать незаменимые аминокислоты (метионин, триптофан, лизин). Белковый обмен находится в тесной связи с углеводным обменом.

Расщепление микробами углеводов сопровождается образованием органических кислот, которые могут распадаться и до конечных продуктов – СО₂ и Н₂О.

Углеводы расщепляются под действием ферментов с образованием глюкозы и мальтозы. Под влиянием ферментов мальтазы, сахаразы, лактазы дисахариды, поступившие внутрь клетки бактерии, подвергаются гидролизу и распаду на моносахариды. В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Часть моносахаров идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, который может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов – брожению (гликолизу) или в аэробных условиях с образованием углекислого газа и воды. Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ). В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления, от которых защищают специфические ферменты (каталаза, пероксидаза, супероксиддисмутаза). У анаэробов эти ферменты отсутствуют – поэтому для них кислород токсичен.

В зависимости от характера конечных продуктов разложения углеводов в анаэробных условиях различают брожение: спиртовое; молочнокислое; пропионовокислое; муравьинокислое; маслянокислое; уксуснокислое.Молекулярный кислород в процессах брожения не участвует. Большинство бактерий, осуществляющих брожение, — облигатные анаэробы. Однако некоторые из них — факультативные анаэробы — способны осуществлять процесс брожения в присутствии кислорода, но без его участия. Иногда присутствие кислорода изменяет течение метаболизма бактериальной клетки – например, подавление спиртового брожения кислородом - на смену которому приходит дыхание. Данный процесс называется эффектом Пастера.

Отношение к кислороду:

· Облигатные аэробы - способны получать энергию только путем дыхания (существовать только в присутствии кислорода).

· Облигатные анаэробы — бактерии, способные расти только в среде, лишенной кислорода (осуществляют только брожение).

· Факультативные анаэробы — бактерии, способные расти как в присутствии, так и в отсутствии кислорода.

· Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода.

Особенностями питания бактериальной клетки являются поступление питательных субстратов внутрь через всю ее поверхность.

Знание всех вышеперечисленных фактов о метаболизме микроорганизмов позволяет довольно успешно культивировать многие значимые их виды в лаборатории. Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов микробной жизнедеятельности.

Для целей культивирования бактерий применяются техники бактериологического метода.

Культивирование бактерий– это один из основных приемов в микробиологии. Для роста и развития бактерийв природе и в лабораторных условияхнеобходимо наличие питательных веществ.Выращивание и поддержание микробных культур влаборатории основано на моделированииестественных условий обитания данного организма, а также на знании особенностей его обмена веществ.

Для культивирования бактерий необходимы:

1) соответствующая по питательным компонентам среда;

2) правильно произведенный посев;

3)оптимальные условия: температура, влажность, аэрация(снабжение О₂) или создание бескислородных условий дляанаэробов;

4) определенной временной интервал для выращивания.Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37 °С в течение 1-2 суток. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша - в 2-3 сутках, а микобактерии туберкулеза - в 3-4 неделях.

Краткая характеристика питательных сред.

Колонии бактерий в лабораторных условиях выращиваются на чашках Петри, которые заполнены желеобразным или полужидким содержимым - это и есть питательные среды.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.

Агар - полисахарид сложного состава из морских водорослей. Крахмал и желатин для уплотнения питательных сред не применяются, т.к. многие бактерии их используют как пищевой субстрат.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

-универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо-пептонный бульон - МПБ, мясо-пептонный агар - МПА);

-специальные - среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (например, среда Левенштейна-Иенсена для возбудителя туберкулеза);

-дифференциально-диагностические - для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

-селективные - для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих (например, пептонная вода – для культивирования холерного вибриона, возбудителя холеры).

- транспортные – используются для сохранения жизнеспособности бактерий при транспортировке (доставке биоматериала от пациента в лабораторию).

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии различной (чаще округлой) формы, различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.

Вид, форма, цвет и другие особенности колоний на плотной питательной среде могут учитываться при идентификации бактерий, а также отборе колоний для получения чистых культур.

Изучение колоний имеет значение в лабораторной диагностике некоторых заболеваний, так возбудитель таких заболеваний, как ожоговые и раневые инфекции, эндокардиты, пневмонии, сепсис - P.aeruginosae, при культивировании на плотной питательной среде характеризуется графитовым блеском колоний, нередко окрашивает питательную среду в зелёный цвет, при культивировании источает цветочный запах.

Колонии возбудителя чумы Y. pestis, выросшие через 18-24 ч инкубации имеют вид мелких глыбок с неровными краями («битое стекло»), через 48 ч края колоний приобретают фестончатый вид и напоминают «кружевной платочек».

Колонии B. anthracis, возбудителя сибирской язвы, на МПА образуют крупные колонии с неровными бахромчатыми краями. От края колонии отходят пучки нитей. Вид колоний напоминает «голову медузы» или «львиную гриву».

Возбудитель дифтерии С. diphtheriae при культивировании на скошенном сывороточном агаре даёт рост, который сравнивают с «шагреневой кожей» – колонии не сливаются. На дифференциально-диагностических кровяных теллуритовых средах патогенные бактерии одного из вариантов С. diphtheriae образуют сухие, матовые, крупные плоские серовато-черные колонии, приподнятые в центре. Периферия колоний светлая с радиальной исчерченностью и изрезанным, волнистым краем - такие колонии напоминают цветок маргаритку.

Протей вызывает колиты, различные гнойно - септические заболевания.Характернымтакже является «ползучий» рост P.vulgaris на пластинчатом агаре при «точечном» посеве в центр чашки. Рост протеев сопровождается гнилостным запахом. Характерен феномен роения – когда бактерии дают на МПА характерный ползучий рост в виде голубовато - дымчатой «нежной вуали».

Возбудитель заболевания легионеллёз (болезнь легионеров) - Legionellapneumophilla - через 3-5 суток на плотных средах образует серыестекловидные колонии с ровными краями.

Таким образом, изучаются такие параметры роста колоний на плотной питательной среде как:

1. Величина. Крупные могут иметь величину до 6 мм и более, а мелкие – меньше 1 мм.

2. Форма. Как правило, различают правильную круглую форму, а также эллипсоидную, розеточную, ризоидную и т.п.

3. Пигментация/Окраска. Разные виды колоний могут быть белыми, либо иметь какую-либо окраску – что также зависит и от среды культивирования.

4. Прозрачность.

5. Рельефность. Различают плоские, плосковыпуклые, куполообразные с возвышенной серединкой, с вдавлением формы и др.

6. Поверхность. Она может быть гладкой, морщинистой, сухой, ослизлой, хрупкой, мучнистой и т.п.

Вопросы для письменного ответа в тетради:

1. Дайте определения понятиям метаболизм, анаболизм и катаболизм.

2. Каковы особенности метаболизма бактерий?

3. Чем различаются экзо- и эндо-ферменты бактерий?

4. Каким образом прокариоты удовлетворяют свои потребности в аминокислотах?

5. Что такое процесс брожения?

6. Влияет ли кислород на процесс брожения? Участвует ли кислород в брожении?

7. Что эффективнее в энергетическом смысле – дыхание или брожение?

8. Дайте определение понятиям облигатные аэробы и облигатные анаэробы.

9. Что необходимо для успешного культивирования бактерий в лаборатории?

10. Приведите классификацию питательных сред а)по консистенции и б)по назначению.

11. Для культивирования какого микроорганизма применяется среда Левенштейна-Иенсена?

12. Что такое колония? (вспомнить из лекций)

13. Какие параметры роста колоний на плотной питательной среде подлежат изучению врачом-микробиологом?

14. Кратко опишите рост на плотной питательной среде таких патогенов, как P.aeruginosae, Y.pestis, B.anthracis, С.diphtheriae, P.vulgaris, L. Pneumophilla.