Использование клетки хозяина для хранения вектора позволяет легко амплифициривать и находить определённые клоны из библиотеки для анализа. Геномную библиотеку можно хранить длительно (в замороженном состоянии). При необходимости отдельные бактериальные или дрожжевые клоны, содержащие фрагменты ДНК с нужными генами или другими элементами генома, выделяют и размножают (клонируют). Клонированные таким способом участки генома выделяют из клеток и используют для решения различных теоретических и практических задач генетики, медицины (в том числе диагностики наследственных болезней) и биотехнологии, а также для картирования геномов.
Скрининг библиотеки, то есть поиск конкретного фрагмента ДНК среди сотен и тысяч других последовательностей, осуществляют методом ДНК-гибридизации при помощи ДНК-зондов . Если исследователь знает хотя бы небольшую последовательность нуклеотидов с искомого участка, он искусственно синтезирует комплементарную последовательность (праймер длиной около 20 нуклеотидов) и метит её или радиоактивным изотопом, или флуоресцентной меткой. С чашки Петри с колониями посредством блоттинга делают реплику: прикладывают к чашке тонкую нитроцеллюлозную или иную мембрану, на которой остаётся отпечаток всех колоний. После этого осуществляют разрушение бактериальных клеток на отпечатке, освобождение ДНК от белков в щелочной среде и денатурацию ДНК до одноцепочечной молекулы. Далее обрабатывают все колонии зондом и смотрят, в какой из колоний зонд присоединился по принципу комплементарности. Эта колония и будет содержать нужный фрагмент ДНК.
|
|
Иногда исследователь не знает последовательности ДНК, которую ищет, но имеет последовательность аминокислот исследуемого белка. Поскольку каждой аминокислоте может соответствовать несколько триплетов нуклеотидов (от одного до шести), то и вероятные кодирующие ДНК могут быть разными. Тогда готовится смесь зондов, которые могут распознать предполагаемую последовательность.
Для создания банка генов необходимо:
1) Выделение всей геномной ДНК
2) Фрагментация ДНК рестриктазами или ультразвуком
3) Очищенные кольцевые молекулы ДНК (векторы) обрабатывают той же рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК добавляют к плазмидной в присутствии лигаз. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК.
4) рекДНК вводят в бактериальные или дрожжевые клетки, где плазмида реплицируется с образованием многих копий.
5) Клонирование бактерий: каждая возникшая колония клеток представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид образует библиотеку геномной ДНК.
|
|
Достоинства: библиотека генов может храниться и использваться неограниченно долго
Недостатки: фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.
Использование:
-источник трансгенов
-источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков
- сохранение генофонда исчезающих видов.
9. Охарактеризуйте векторы для клонирования крупных фрагментов ДНК; объясните, в каких случаях они используются.
Преимущества использования крупных фрагментов ДНК для клонирования:
- существенно облегчается создание геномных библиотек
- удается провести функциональный анализ полных больших генов или их комплексов
- Векторы на основе бактериофага ƛ
С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек часто приходится работать с более крупными фрагментами. Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага К Е. coli. После проникновения фага X в клетку Е. coli
• Лямбда фаг — умеренный бактериофаг с двухцепочечной геномной ДНК размером 45 тыс. п.н., размножающийся в клетках E. coli; в зависимости от характера взаимодействия вируса и клетки-хозяина развитие Лямбда фага может происходить по литическому или по лизогенному пути. Размер ДНК фага ƛ составляет примерно 50 т. п. н., причем значительная ее часть (около 20 т. п. н.) несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК.
• После проникновения фага X в клетку Е. coli события могут развиваться по двум сценариям.
• Если реализуется литический цикл, то фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин клетка разрушается (лизирует) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц.
• При альтернативном варианте развития событий фаговая ДНК включается в хромосому Е. coli как профаг и
• реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными генами (состояние лизогении).
• Однако при недостатке питательных веществ или иных неблагоприятных обстоятельствах интегрированная фаговая ДНК высвобождается, и запускается литический цикл развития.
• Литический цикл развития:
• Инфекционная фаговая частица имеет головку, в которой заключена плотно упакованная ДНК длиной примерно 50 т. п. н., и отросток с отходящими от него тонкими белковыми нитями (фибриллами). Сборка головки и отростка и упаковка ДНК четко скоординированы. ДНК фага ƛ — это линейная двухцепочечная молекула длиной 50 т. п. н. с одноцепочечными 5'-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом. После того как фаговая ДНК проходит через отросток и попадает в Е. coli, cos-концы соединяются с образованием кольцевой молекулы. На раннем этапе литического цикла в результате репликации кольцевой молекулы ДНК образуется линейная молекула, состоящая из нескольких сегментов длиной 50 т. п. н. (рис. А).
• Каждый из таких сегментов упаковывается в белковую головку, к последней присоединяется уже собранный отросток и образуется новая фаговая частица (рис.Б). При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т. п. н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т. п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку.
|
|
При репликации кольцевой ДНК бактериофага ƛ образуется линейная молекула, состоящая из повторяющихся сегментов длиной примерно 50 т. п. н. Каждый из этих сегментов представляет собой полноразмерную фаговую ДНК. Фаговая головка вмещает один такой сегмент, затем к головке присоединяется уже собранный отросток
10. Опишите способы оптимизации экспрессии клонированных генов в клетках прокариот.
Основная цель экспериментов по клонированию генов в составе рекомбинантных ДНК, которые предполагается использовать в биотехнологии, – подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. Для этой цели в биотехнологии используют специализированные векторы – экспрессионные (рис. 54) и соответствующие клетки-реципиенты.
Способность к экспрессии – одно из самых важных свойств гена. За это свойство отвечают различные генетические элементы (последовательности нуклеотидов), которые необходимо встроить в векторную молекулу, несущую ген. Такие последовательности нуклеотидов принято называть регуляторными. Напомним, что к ним относятся последовательности, которые регулируют прочность и точность связывания с молекулой ДНК-матрицы фермента РНК-полимеразы, а также последовательности, сигнализирующие об окончании процесса транскрипции (промотор и терминатор соответственно). Кроме того, синтезируемая в процессе транскрипции мРНК должна содержать в своей структуре последовательности, которые обеспечат ее точное связывание с малой субъединицей рибосомы, тем самым, гарантируя правильную трансляцию. А это требует введения в структуру рекомбинантной ДНК участков, которые получили название сайты связывания рибосом (rbs – ribosome bind site). Упомянутые структурные элементы ДНК обеспечивают также и достаточную копийность как мРНК, так и синтезируемых полипептидов. Также при конструировании экспрессирующихся рекомбинантных ДНК необходимо предусмотреть место в клетке, где будет осуществляться экспрессия вводимых последовательностей ДНК: в цитоплазме в составе плазмидной ДНК или после интеграции в хромосомную ДНК хозяина. Кроме того, в структуре рекомбинантной ДНК должна содержаться информация и о месте локализации в клетке синтезируемого конечного продукта, т.е. белка. Однако, понятие системы экспрессии включает в себя не только структурные модули экспрессирующихся рекомбинантных ДНК, но и особенные характеристики клеток-хозяев, где планируется осуществлять экспрессию. В данном разделе будут рассмотрены некоторые общие моменты, которые необходимо учитывать при выборе системы экспрессии.
|
|
Следует отметить, что никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. В то же время, можно выделить наиболее важные свойства систем экспрессии:
1. Тип промотора и терминатора транскрипции.
2. Прочность связывания мРНК с рибосомой.
3. Число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки).
4. Конечная локализация синтезируемого продукта.
5. Эффективность трансляции в организме хозяина.
6. Стабильность продукта в хозяйской клетке.
В исследовательской работе, а также для производства важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК наиболее часто используют систему экспрессии клеток E.coli. Это связано с тем, что генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены. Кроме того, это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков.
При рассмотрении генетических векторов для клонирования ДНК (см. раздел векторы) мы познакомились с семейством векторов pUC, в состав которых входят некоторые модули системы α-комплементации лактозного оперона E.coli. Эти регуляторные элементы транскрипции Lac- оперона дают возможность использовать эти векторы для экспрессии в клетках кишечной палочки чужеродных генов. Наличие сильного регулируемого промотора, имеющего большое сродство к РНК-полимеразе, обеспечивает эффективную транскрипцию после наращивания больших количеств клеточной массы.
11. Объясните, в чем преимущество стратегии синтеза белка-мишени в составе химерного продукта; опишите, как создают химерный белок.
Очень часто чужеродные белки, особенно небольшие, обнаруживаются в гетерологичных хозяйских клетках лишь в минимальных количествах. Такой кажущийся низкий уровень экспрессии кодирующих их генов во многих случаях объясняется деградацией чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присоединении продукта клонированного гена к какому-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клонированного гена оказывается защищенным от расщепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов.
Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соответствующих генов. В самом простом виде векторная система слияния предусматривает включение гена-мишени или его сегмента в кодирующий участок клонированного гена-хозяина.
Если при объединении сегментов ДНК происходит изменение рамки считывания, т. е. последовательность кодонов детерминирует укороченный или неправильный трансляционный продукт, то не сможет образоваться и функционально активная форма белка, и не только!
Расщепление химерных белков: Можно писать про инсулин: сначала синтезируют химерный белок (проинсулин) далее убирают С-цепь, тем самым активируют его à инсулин (если его сразу синтезировать без С-цепи, то будет нестабильным!)