Критически оцените основные механизмы защиты продуцента от действия собственных антибиотиков

Организмы, продуцирующие антибиотики, устойчивы к их действию. Причем микроорганизмы, выделенные из природных источников («дикие» штаммы), имеющие невысокую биосинтетическую активность, резистентны к собственному антибиотику на уровне мембран. Высокопродуктивные мутанты микроорганизмов защищаются от антибиотиков, синтезируемых ими, в результате инактивации их ферментами или образования некоторых метаболитов (например, цистеина}, инактвирующих собственные антибиотики, а также благодаря клеточным мембранам, препятствующим проникновению антибиотика в клетку, и генам устойчивости.

Основные механизмы защиты микроорганизмов от собственных антибиотиков

Во-первых, клетки микроорганизмов - продуцентов некоторых антибиотиков могут вырабатывать ферменты, инактивирующие собственные антибиотические вещества. Такой механизм имеется у продуцентов аминогликозидов, макролидов, грамицидина С, хлорамфеникола, полимиксинов и некоторых других.

Во-вторых, микроорганизмы могут защитить себя от собственных антибиотиков в результате образования определенных метаболитов, которые способны инактивировать синтезированные антибиотики. Так, выработка цистеина может выполнить эту функцию по отношению к стрептомицину, пенициллину, глиотоксину.

В-третьих, микроорганизмы активно выводят из клеток образуемый ими антибиотик, препятствуя его обратному проникновению в клетки. Однако если часть антибиотика все же попадет в клетку, то он может там инактивироваться в результате, например, фосфорилирования. Такой процесс обнаружен у продуцента неомицина.

В-четвертых, микроорганизмы могут защитить себя от действия образуемого ими антибиотика в результате того, что в процессе биосинтеза антибиотик скапливается в особых клеточных образованиях («цистернах»), а затем выводится из клетки. Указанный путь характерен для продуцентов эритромицина, хлортетрациклина, виомицина, пенициллина и некоторых других.

В-пятых, продуценты антибиотиков могут быть резистентными по отношению к действию собственных антибиотических веществ в результате изменения мишени или инактивации антибиотика посредством модификации его молекулы. Такие механизмы обнаружены у стрептомицетов, вырабатывающих актиномицины, макролиды и некоторые другие антибиотики.

В-шестых, устойчивость многих продуцентов антибиотических веществ к образуемым ими антибиотикам связана с наличием у них генов устойчивости. Это имеет место у продуцентов аминогликозидных антибиотиков, актиномицинов, макролидов и др. У ряда стрептомицетов структурные гены биосинтеза антибиотиков (их число варьирует от 1 О до 30) и гены устойчивости к ним в составе хромосомной ДНК, как правило, располагаются в одном кластере.

В-седьмых, устойчивость стрептомицетов, вырабатывающих, например, актиномицины, к собственным антибиотикам может проявляться также в результате изменения транскрипции под влиянием антибиотика и наличия в клетках продуцента актиномицинсвязывающих белков.

Таким образом, продуценты антибиотических веществ в процессе эволюции выработали механизмы защиты от действия образуемых ими мощных биологически активных продуктов жизнедеятельности. Вместе с тем антибиотики, находясь в клетках продуцента или вне их, могут оказывать определенное воздействие на процессы метаболизма собственного продуцента.

Сравните и обсудите методы выделения микроорганизмов, продуцирующих антибиотики (классический метод и метод замораживания-оттаивания почвы)

Классика. Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки. Определенную навеску почвы, тщательно растертую в ступке с небольшим объемом воды, количественно переносят в колбу со стерильной водой. Содержимое колбы встряхивают в течение 5 мин, а затем из водной суспензии делают ряд последовательных разведений, которые высевают на соответствующую агаризованную среду. В дальнейшем для получения чистых культур отдельные колонии после инкубации в термостате при нужной температуре пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром. Каждую чистую культуру микроорганизма пересевают на различные по составу среды и после достаточно хорошего развития проверяют ее антибиотические свойства.

Метод замораживания-оттаивания почвы. Известно, что в почве микроорганизмы находятся в адсорбированном на частицах состоянии. Для полноты десорбции микроорганизмов с почвенных частиц применяют химические методы, при которых почвенные образцы обрабатывают различными детергентами, и физические, в основе которых лежит метод механического растирания образцов почвы. Для лучшей десорбции микроорганизмов с почвенных частиц рекомендуется использовать метод замораживания-оттаивания почвы. Суть метода состоит в следующем. Отобранный для выделения стрептомицетов образец почвы помещают в испаритель бытового холодильника при температуре -8 °С. Через час образец извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре до полного оттаивания. Процедуру замораживания-оттаивания повторяют дважды. Затем навеску почвы помещают в стерильную воду, взбалтывают суспензию в течение 15 мин на круговой качалке при 230 об/мин, после чего различные разведения суспензии высевают на питательную агаровую пластинку в чашках Петри. Метод замораживания-оттаивания образцов почвы позволяет обнаружить в них в 1,2-3,6 раза больше стрептомицетов, чем в тех же образцах без замораживания.

Сравните и обсудите методы выделения микроорганизмов, продуцирующих антибиотики (метод высева почвы на питательный агар, предварительно засеянный тест-организмом и метод использования сред, содержащих антибиотики)

Высев почвы на питательный агар, предварительно засеянный тест-организмом. Поверхность питательного агара засевают тест-культурой необходимого организма, после чего на агаровую пластинку раскладывают небольшие (не более просяного зерна) комочки почвы или же почву наносят в виде пыли, распределяя ее по всей поверхности пластинки. Затем чашки помещают в термостат и через определенный промежуток времени (24-48 ч, а иногда и более) просматривают кусочки почвы или отдельные ее участки, вокруг которых образовались зоны задержки роста тест-организма. Из этих участков выделяют чистые культуры организмов и изучают их. Метод можно модифицировать. На чашки Петри с мясопептонным агаром, предварительно засеянным тест-организмом, микробиологической петлей наносят отдельными каплями взвесь почвы. На каждую чашку наносят 10-20 капель, которые, подсыхая, оставляют после себя изолированные комочки почвы. Через 1-2 сут. нахождения чашек в термостате при 26-35 °С комочки почвы обрастают колониями и вокруг некоторых из них обнаруживаются зоны задержки роста тест-организма. Комочки, окруженные зонами, рассевают на свежие чашки с агаром, и после того как вырастут отдельные колонии, их отсевают для получения чистых культур, которые исследуют.

Применение питательных сред, содержащих антибиотики. Высев почвенной суспензии на агаровые пластинки вызывает трудности для развития редко встречающихся видов актиномицетов в результате быстрого размножения бактерий и широко распространенных в почвах видов актиномицетов. Поэтому для направленного выделения определенных групп микроорганизмов в среды для высева почвенной суспензии добавляют различные антибиотики. При добавлении антибиотиков к среде для культивирования микроорганизмов обычная микрофлора подавляется и создаются условия для развития устойчивых к этим антибиотикам форм микробов; последние могут оказаться новыми или редкими видами, способными образовывать и новые антибиотики. Для этих целей часто используют антибактериальные и противогрибные препараты. Для выделения актиномицетов применяют среды, содержащие в своем составе такие антибиотики, как тетрациклины, неомицин, нистатин, стрептомицин, хлорамфеникол, пенициллин и др. При выделении продуцентов новых антибиотических веществ используют среды, содержащие стрептомицин в концентрациях от 25 до 100 мкг/мл и рубомицин — от 5 до 20 мкг/мл. В случае добавления к среде стрептомицина значительно подавляется рост наиболее часто встречающихся видов S. griseovariabilis, S.flavochromogenes, S. griseolis, S. aureofaciens, S. griseus и др. и выделяются виды актиномицетов, которые не обнаруживались на той же среде без стрептомицина. С повышением концентрации стрептомицина в среде общее количество выделяемых стрептомицетов уменьшается, однако при этом вырастают новые виды актиномицетов. Внесение в среду для высева почвенной суспензии рубомицина в значительной степени подавляет рост стрептомицетов и нокардиа. Довольно устойчивы к этому антибиотику представители секций Roseus, Helvolo-Flavus и Albus. В указанных условиях в значительном количестве вырастают виды стрептомицетов, не образующие воздушный мицелий. Продуценты, например, аминогликозидных антибиотиков могут быть найдены, как правило, только среди стрептомицетов, устойчивых к действию этих антибиотиков. Большое внимание уделяется поиску новых антибиотиков, образуемых сравнительно небольшим родом актиномицетов Micromonospora - применяют селективные среды, содержащие 1 мкг/мл гентамицина, который подавляет рост быстрорастущей микрофлоры, в том числе и стрептомицетов. Это дает возможность в 2-3 раза повысить число развивающихся колоний микромоноспора и при этом в 3 раза увеличить число штаммов, способных вырабатывать антибиотики. Представителей рода Actinomadura обычно выделяют из почв на богатых питательных средах, содержащих антибиотики.

Сравните и обсудите методы выделения микроорганизмов, продуцирующих антибиотики (метод обработки почвенного образца карбонатом кальция и метод центрифугирования почвенной суспензии)

Обработка почвенного образца карбонатом кальция. Увеличение числа выделенных культур стрептомицетов примерно на два порядка наблюдается при обработке почвенного образца карбонатом кальция и при инкубировании во влажных условиях. Впервые метод был предложен П. Тсао с соавторами в 1960 г. и модифицирован И.В. Алферовой и Л.П. Тереховой в 1988 г. Образец почвы смешивают с порошком карбоната кальция в соотношении 10: 1 и инкубируют во влажной камере при температуре 28 °С. Влажность обеспечивается путем помещения в чашки Петри кусочков фильтровальной бумаги, пропитанных дистиллированной водой и прикрепленных к крышке чашки. Увеличение общего числа выделяемых актиномицетов из таких образцов почвы, по-видимому, связано с тем, что ионы кальция инициируют прорастание спор стрептомицетов.

Метод центрифугирования почвенной суспензии. Для выделения стрептомицетов из почв, и особенно из почв в весеннее время, когда в ней развивается большое число грибов и бактерий, применяют метод центрифугирования почвенной взвеси. Метод основан на различии скоростей оседания отдельных видов микроорганизмов в центробежном поле. При 3000 об/мин в течение 20 мин частицы, соответствующие по размерам спорам плесеней или клеткам бактерий типа В. Частицы же, соответствующие по размерам спорам или отдельным обрывкам мицелия стрептомицетов, при данной скорости центрифугирования оказываются в поверхностном слое жидкости. Высевая надосадочную жидкость, в большинстве случаев (до 92\%) на пластинках питательного агара удается получить только колонии актиномицетов.