Изучение трансформации, трансдукции, конъюгации и лизогенной конверсии

В настоящее время трансформацией называют процесс переноса информации с помощью ДНК от клетки‑донора к клетке‑реципиенту и замещения в последней в результате рекомбинации специфической последовательности нуклеотидов генома. Термин «трансформация» появился в 1928–1934 гг., когда было обнаружено, что некоторые штаммы бактерий, выращенные в присутствии убитых клеток или в культуральных фильтратах и экстрактах из других родственных штаммов, могли приобретать некоторые свойства этих штаммов. Открытие трансформации связано с исследованиями Ф. Гриффита, сообщившего в 1928 г., что при введении мышам смеси живых бескапсульных невирулентных пневмококков (типа II) и убитых нагреванием капсульных вирулентных пневмококков (типа I) они погибали. Из крови мышей были выделены живые капсульные вирулентные пневмококки (тип I), появившиеся в результате превращения невирулентных пневмококков в вирулентные. Это же явление при выращивании клеток R‑типа (бескапсульные шероховатые колонии) в бульоне с антисывороткой против этого типа и убитыми нагреванием клетками было воспроизведено in vitro М. Даусоном и Р. Сиа (1931), а вслед за ними Д. Алловеем (1932), но уже не с живыми микробами, а с бесклеточными экстрактами из бактерий, имеющих S‑тип (капсульные, слизистые) колонии. Сущность этого явления была выяснена в 1944 г. О. Эвери, К. Мак‑Леодом и М. Мак‑Карти, установившими, что трансформирующим агентом является высокомолекулярная ДНК (см. главу 23).

Дальнейшее изучение трансформации проводилось при учете в качестве маркеров различных признаков: капсулообразования (для пневмококков), устойчивости к антибиотикам, потребности в факторах роста (X. Раппапорт, 1959; Л. Толмач, Р. Херриотт, 1962; и др.). Исследования с использованием последних двух маркеров дали возможность детально разработать проблемы множественной трансформации и «сцепления» различных генов. Важное место среди этих исследований заняли работы японских ученых X. Иошикавы и Н. Сеока, которые в 1963 г. разработали метод картирования сцепленных генов у Bacilluss ubtilis.

Изучение динамики процесса трансформации показало, что частота появления трансформантов зависит от физиологического состояния реципиентных клеток. Наибольшая чувствительность (компетентность) клеток к трансформирующему агенту появляется в конце логарифмической и начале стационарной фаз, а затем снижается. Исследованиями М. Фокса и Р. Хочкисса (1957) на пневмококках была выявлена зависимость степени компетентности клеток реципиента к ДНК донора от синтеза белка. Было показано также, что число трансформированных клеток увеличивается до определенного максимума при повышении концентрации введенной ДНК, а также зависит от температуры культивирования клеток, pH среды, аэрации, наличия некоторых катионов. Исследования с меченым фосфором P³² в молекуле ДНК позволили Л. Лерману и Л. Толмач (1957) сделать вывод о том, что обязательным условием проникновения в клетку ДНК является ее высокая полимерность и сохранение двухтяжной структуры.

Важным моментом в изучении трансформации у бактерий было также выяснение вопроса о том, каким образом происходит включение генетического маркера, несущего определенный признак, в геном бактериальной клетки и когда начинаются его репликация и проявление. Избрав в качестве такого маркера устойчивость к стрептомицину, Г. Эфрусси‑Тейлор и Р. Летарже (1955) показали, что начало репликации этого маркера зависит от момента высева трансформируемой культуры на селективную стрептомициновую среду. Извлечением ДНК из реципиентных клеток в различные сроки после включения трансформирующей ДНК эти исследователи устанавливали время включения генетического маркера в геном реципиентной клетки, т. е. определяли время рекомбинации между фрагментами ДНК‑донора и ДНК‑реципиента. По данным Хочкисса (1956) и Эфрусси‑Тейлора (1960), скорость необходимой для этих процессов интеграции экзогенной ДНК зависит от нескольких факторов – величины фрагментов ДНК, природы нуклеотидов, расположенных вблизи от изучаемого маркера, и т. п.

В период интенсивного развития генетики бактерий внимание ученых привлекли вирусы бактерий – бактериофаги. Знакомство с природой бактериофагов выявило огромную перспективность изучения роли этих агентов в передаче генетических признаков для решения общих проблем генетики. В результате уже к 50‑м годам генетика бактериофага по темпам развития опередила генетику бактерий (см. главу 25).

Начало изучения роли бактериофага в осуществлении бактериальных рекомбинаций связано с исследованиями Ж. Борде и М. Чуке, открывших в 1921 г. явление лизогении (см. главу 25). Данное ими определение лизогении как наследственной способности бактерий спонтанно продуцировать бактериофаг при отсутствии экзогенного заражения сохранилось и по сегодняшний день. На основе исследований Ф. Бернета, М. Дельбрюка и особенно А. Львова (Нобелевская премия, 1965), проливших свет на истинную природу явления лизогении, стало возможным открытие Дж. Ледербергом и Н. Циндером (1952) нового способа переноса генетической информации с помощью бактериофага, названного ими трансдукцией. Авторы обнаружили это явление при культивировании двух мутантных ауксотрофных штаммов Salmonella tiphimurium в U‑образной трубке, разделенной ультратонким пористым стеклянным фильтром. После инкубации фаг, содержавшийся в одном из штаммов (22А) – триптофанзависимый, проникал в другой штамм (2А) – гистидинзависимый и переносил наследственное свойство – способность к росту в отсутствие триптофана.

Развивая далее сделанное открытие, Циндер показал, что в основе трансдукции лежит включение фрагментов лизированной фагом бактериальной клетки в фаговую корпускулу. Молекулярная основа этого процесса состоит в передаче чувствительной бактериальной клетке с ДНК фага фрагмента ДНК лизированной бактерии, который интегрируется с участком бактериального генома. Наряду с этим видом трансдукции, названной П. Хартманом (1957) общей неспецифической трансдукцией, была идентифицирована и так называемая ограниченная специфическая трансдукция. Этот тип трансдукции, как показали М. Морзе и Дж. и Е. Ледерберги (1955–1956) на фаге лямбда (λ) лизогенного штамма Е. coli К‑12, осуществляется при помощи фагов, ДНК которых соединяется лишь с одним определенным участком бактериального генома.

Как выяснили Ф. Кауфман (1953), М. Демерец и П. Хартман (1959), Е. Энглесберг и Л. Барон (1959), в процессе общей трансдукции с помощью фага Salmonella tiphimurium Р22 можно трансдуцировать любой ген из многих единичных или сцепленных друг с другом генов, определяющих, например, питательные потребности, серологические и ферментативные признаки, устойчивость к антибиотикам, вирулентность, наличие жгутиков и т. д. При ограниченной трансдукции трансдуктанты обычно нестабильны и могут выщеплять стабильное нелизогенное потомство. Они оказываются, таким образом, не рекомбинантными, а гетерогеномными.

Дальнейшее изучение трансдукции позволило Б. Стокеру (1953), а затем Дж. Ледербергу (1956) описать так называемую абортивную трансакцию, характеризующуюся тем, что перенесенный признак (фермент) при каждом клеточном делении наследует только одна из дочерних клеток. Как показали исследования с дефектными фагами (В. Арбер, Г. Колленбергер, 1958), при абортивной трансдукции фрагмент бактериальной ДНК, захваченный фагом, вводится в бактерию‑реципиент и функционирует в ней, но не интегрируется и не реплицируется с бактериальным геномом. Использование всех трех форм трансдукции способствовало решению многих сложных генетических проблем.

Изучение третьего вида рекомбинаций у бактерий конъюгации началось с исследований Дж. Ледерберга и Э. Тейтума, которые в 1946 г. впервые получили положительные результаты при совместном культивировании мутантных ауксотрофных штаммов Е. coli, не способных к росту на минимальной среде. Авторы выделили те клетки, которые в результате рекомбинации получили способность к росту на такой среде и проявляли признаки обоих родительских типов.

В 50‑х годах Б. Хейс установил, что при бактериальном скрещивании наблюдается полярность, причем один из партнеров каждой конъюгирующей пары является донором, или «самцом», а другой – реципиентом, или «самкой», т. е. партнеры, участвующие в конъюгации, гетероталличны. Им были выделены два половых типа – F⁺ (донорные, или мужские штаммы) и F^‑ (реципиентные, или женские штаммы). В 1956 г. Дж. Ледерберг представил прямые микроскопические доказательства образования конъюгационных пар в смешанных культурах, рекомбинирующих штаммов.

До 1960 г. было принято считать, что конъюгация по своей природе аналогична половому процессу высших организмов и заключается в слияний двух гаплоидных клеток с образованием полноценной диплоидной зиготы, которая в результате редукционного деления дает начало гаплоидным рекомбинантным клонам. Позднее в результате исследовании Ф. Жакоба, Ж. Моно и их сотрудников – Е. Вольман и Б. Хейс было показано, что, несмотря на гомологичность конъюгации и полового процесса, первая отличается специфическими особенностями, главная из которых состоит в неполной передаче хромосомного материала, благодаря чему образуется частичная диплоидная зигота, или, по терминологии Жакоба и Вольман, мерозигота. Отсюда весь процесс был назван меромиксисом.

В 1963 г. С. Луриа дифференцировал три специальных генетических фактора, необходимых для установления клеточных контактов при конъюгации, которые он назвал «конъюгонами»: F – факторы фертильности, cf – факторы колициногенности – генетические структуры, которые передаются при клеточном контакте и являются ответственными за образование колицинов – антибиотиков полипептидной природы, образуемых некоторыми штаммами Е. coli, и RTF – фактор передачи устойчивости к антибиотикам. При наличии в клетке‑доноре любого из этих факторов может происходить конъюгация с родственной клеткой, не несущей такого фактора.

Дальнейшие исследования да молекулярном уровне показали, что по своей химической природе конъюгоны являются ДНК‑содержащими элементами; они имеют, вероятно, кольцевую структуру, способны к самоудвоению и связаны с клеточной мембраной.

Приведенные представления о природе конъюгонов находятся в тесной связи с открытием в 1958 г. Жакобом и Вольман эписом – дополнительных внехромосомных генетических элементов, которые могут находиться как в автономном, так и в интегрированном с хромосомой состоянии. Ввиду накопления данных, свидетельствующих о том, что генетические элементы типа F и cf ‑конъюгонов отличаются от ДНК‑содержащих структур («хромосом») лишь по величине и темпам репликации, Ф. Жакоб и С. Бреннер (1963) предложили для них общее название репликоны. Как теперь известно, нехромосомные репликоны, или эписомы, служат передатчиками генетической информации при вирусной конверсии, сущностью которой является привнесение с помощью фага дополнительной информации, содержащейся в фаговой ДНК, которая в рекомбинации не участвует; изменения же некоторых наследственных признаков происходят за счет этих функционирующих битов информации. При этом изменения наблюдаются лишь до тех пор, пока фаговая ДНК внесенная внутрь данной клетки, сосуществует с бактериальной.

Явление генетической рекомбинации у актиномицетов впервые описал в 1955 г. Г. Сермонти. Двумя годами позднее С.И. Алиханян и С.З. Миндлин сообщили об использовании биохимических мутантов Actinomyces rimosns для получения гибридных форм. Однако механизм осуществления рекомбинаций у актиномицетов оставался до самого последнего времени неясным. В настоящее время можно считать установленным, что механизм генетической рекомбинации у актиномицетов принципиально сходен с таковым у бактерий. В то же время актиномицеты с их сложной морфологической организацией стали ценным объектом генетики микроорганизмов. В результате генетических исследований было показано, что актиномицеты хорошо растут на простых синтетических средах и это обеспечивает получение у них разнообразных ауксотрофных линий; хорошо спорулируют, образуя в большинстве случаев легко отделяющиеся друг от друга гаплоидные споры; подобно бактериям, у них имеются специфические фаги (актинофаги) и известно явление лизогении. Актиномицеты служат продуцентами подавляющего большинства антибиотиков и классическими объектами в селекции промышленных микроорганизмов.

Методы генетического анализа рекомбинантов у актиномицетов были разработаны Дж. Хопвудом и Г. Сермонти (1962). Один из них основан на анализе гаплоидных рекомбинантов, другой – на анализе в гетероклонах (гетерогенные колонии, которые вырастают не из гаплоидных спор, как обычные гаплоидные рекомбинанты, а из диплоидных или частично диплоидных, в связи с чем они не прорастают на селективных для гаплоидных рекомбинантов средах). Образование гетероклонов, т. е. потомства мерозигот, несущих помимо генома одного из родителей часть генома другого родителя, свидетельствует о сходстве генетической рекомбинации бактерий и актиномицетов. Принципиальной особенностью анализа в гетероклонах оказалась возможность определения величины сцепления между генетическими локусами в абсолютных единицах. Согласно гипотезе, выдвинутой этими учеными, для гетероклонов характерна неполная диплоидность ядра: они происходят из неполных гетерозигот, в которых отсутствует один или два конечных сегмента хромосомы в каждой группе сцепления. Исследования Хопвуда на Str. coelicolor (1965) послужили доводом в пользу представления не о линейных группах сцепления локусов, а о единой кольцевой группе, в результате чего жизнеспособные рекомбинанты возникают только благодаря четному числу перекрестов. Эта же особенность сцепления свидетельствует о сходстве организации генетического материала у бактерий и актиномицетов. В то же время отсутствие четких результатов по передаче и наследованию фактора фертильности (фактора F), а также отсутствие штаммов Hfr не позволяет еще полностью гомологизировать системы половой полярности у бактерий и актиномицетов.

Впервые о возможности генетической трансдукции у актиномицетов сообщили в 1959 г. С.И. Алиханян и Т.С. Ильина, которые в 1960 г. описали трансдукцию с помощью актинофага, выделенного из штамма Act. olivaceus, нуждающегося в метионине, гистидине и цистине. В отличие от бактерий, трансдуктанты у актиномицетов имеют не один, а два типа. В свою очередь рекомбинация у актинофагов, проявляющаяся в основном в изменении их литических свойств, так же как и у бактериофагов, была описана в 1969 г. С.И. Алиханяном и Н.Д. Ломовской.

Начало изучению рекомбинаций у несовершенных грибов было положено открытием в начале 50‑х годов Г. Понтекорво у Aspergillus nidulans явления, названного парасексуальным процессом. Механизм этого процесса, как было показано, не отличается по существу от механизма рекомбинации при настоящем половом процессе. X. Хансен (30‑е годы), Г. Понтекорво (1946), Дж. Л. Джинкс (1952), Дж. А. Ропер (1952) и другие установили, что парасексуальный цикл у грибов состоит из трех последовательных этапов: образования гетерокарионов форм, совмещающих ядра двух разных типов; возникновения в мицелии гетерокариона гетерозиготных диплоидных ядер в результате слияния двух ядер разных типов; образования рекомбинантных форм благодаря митотическому расщеплению. В настоящее время известно, что парасексуальный процесс довольно широко распространен среди грибов. Механизм его может отличаться у различных видов; он может быть использован как при генетическом анализе, так и при селекции видов, представляющих практический интерес.

Глава 8