Вирусологические исследования

Проводят их с целью выделения вирусов, подробного изу­чения их свойств и выяснения роли в этиологии болезни.

В настоящее время выделение вирусных агентов произво­дят на однослойных клеточных культурах, которые выращи­вают в сосудах (пробирках, матрацах) in vitro. Однослойные клеточные культуры, которые являются своеобразной пита­тельной средой для вирусов, могут быть первичными и пере­виваемыми.

Первичные клеточные культуры. Первичные однослойные клеточные культуры получают путем расщепления ферментом (трипсином, панкреатином, версеном) ткани рыб. Для этого чаще всего используют недозрелые гонады, почки, плаватель­ный пузырь и кожу живых рыб. После расщепления клетки собирают и разводят в специальных питательных средах, ко­торые вырабатываются медицинской и ветеринарной промыш­ленностью (основная среда Игла, минимальная среда Игла, среда 199, гидролизат лактальбумина). К данной среде до­бавляют 5—10 % сыворотки крови крупного рогатого скота. Полученную клеточную взвесь разливают в пробирки или флаконы и выращивают в термостате при температуре 22— 26 °С. На 2—5-й день клетки разрастаются и образуют сплошной слой (монослой), который и используют для выде­ления вирусов.

Перевиваемые клеточные культуры. Перевиваемые линии клеток отличаются от первичных тем, что они имеют неогра­ниченную энергию роста и пересеваются из сосуда в сосуд, то есть производится субкультивирование.

В нашей стране выращивают в основном две перевиваемые клеточные линии — ЕРС (полученную из эпителия оспенных разростков карпа) и FHM (полученную из кожно-мышечной ткани пимефала).

Для поддержания непрерывного роста клеточных линий после образования монослоя проводят регулярное субкульти­вирование, для чего:

старую питательную среду из пробирок удаляют, клеточ­ный слой заливают раствором смеси трипсина и версена (раст­вор трипсина-версена вносят в сосуд из расчета полного покрытия клеточного слоя) и оставляют на 2—4 мин для воздействия его на клетки. После помутнения клеточного

206

слоя раствор ферментов удаляют, а в сосуд вносят небольшое количество питательной среды и встряхивают до полного от­деления клеток от стекла; в качестве питательной среды ис­пользуют минимальную среду Игла (MEM) или при отсутствии ее — основную среду Игла (среда 199 или гидролизат лак-тальбумина) с добавлением 5—10 % сыворотки крови телят и смеси антибиотиков: пенициллина — 100 ЕД, стрептомицина 200 мкг, а при угрозе заноса плесени — нистатина — 5—50 мкг на 1 мл; для получения однородной клеточной суспензии про­водят пипетирование в течение 1—2 мин, после чего добавля­ют питательную среду, в 4 раза больше первоначально ис­пользованной для культивирования. Суспензию клеток разли­вают в пробирки по 1 мл или в матрацы (в зависимости от емкости) и выращивают в термостате при температуре 24— 26 °С. Клеточный слой (монослой) развивается на 2—3-й сутки и может быть использован для заражения исследуемым мате­риалом.

Порядок исследования. Во флакон с 10 мл соле­вого раствора Хеикса, содержащего 500 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина в 1 мл, вносят стерильной пастеров­ской пипеткой 1 мл 10 %-ной суспензии, приготовленной из тщательно растертого исследуемого материала на буферном или физиологическом растворе поваренной соли. Выдерживают 60—90 мин при комнатной температуре, затем отсасывают мнкропипеткой надосадочную жидкость и вносят по 0,2 мл в клеточные культуры. Для исследования одной пробы отби­рают 8—10 пробирок с хорошо развитым монослоем, половину из которых используют для заражения, а остальные — для кон­троля.

Зараженные клеточные культуры выдерживают при комнат­ной температуре в течение 40—60 мин (для адсорбции вирус­ного агента на клетках), после чего доливают в пробирки по 0,8 мл питательной среды, содержащей 1 % сыворотки крови телят (поддерживающая среда), и инкубируют в термостате при температуре 22—26 °С.

Ежедневно просматривают зараженные культуры под ми­кроскопом и учитывают результаты. При появлении дегенера­ции клеточного слоя в результате цитопатического действия (ЦПД) вируса проводят последовательные пассажи. ЦПД после третьего пассажа учитывают как специфическое дей­ствие вирусного агента.

В дальнейшем подробно изучают свойства выделенного ви­руса: патогенность для рыб (биопроба), морфологию при помощи электронной микроскопии, устойчивость к физическим II химическим факторам воздействия, а также аппн'енные СВОЙ­СТВ ai

207

Бактериологические исследования

Их производят для выяснения роли выделенных бактерий в этиологии болезни и определения чувствительности к анти­биотикам.

Для исследования берут только живую рыбу. При взятии материала соблюдают правила асептики.

Прежде чем приступить к работе, необходимо приготовить стерильные инструменты, посуду и питательные среды. В ка­честве питательных сред при бактериологических исследованиях в ихтиопатологии чаще всего используют мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, мясо-пептонный желатин (МПБ, МПА, МПЖ), приготовленные по прописям, общепринятым в бактериологии. Первичные посевы для накопления бактерий производят обычно на МПБ, МПА, МПЖ.

Прежде всего исследуют материал с пораженных участков кожи, мышц, жабр (слизь, язвы, абсцессы, фурункулы и др.). Язвы перед отбором материала промывают стерильным физио­логическим раствором, содержимое абсцессов и фурункулов набирают пастеровской пипеткой, соблюдая правила асептики. Кровь для посевов берут из сердца или хвостовой вены.

По окончании посевов из поверхностного материала вскры­вают рыбу и производят посевы из внутренних органов.

Рыбу вскрывают на пробковых или деревянных досках, обработанных спиртом или 3—5 %-ным раствором карболовой кислоты. Обычно рыбу кладут на правый бок. Мелких рыб фиксируют препаровальными иглами, а крупных экземпляров обездвиживают, разрушая спинной мозг. Туловище рыбы с ле­вой стороны освобождают от слизи и чешуи и протирают спиртом. Вскрытие начинают с брюшной стенки выше ануса и дугообразно делают ножницами разрез вперед и вверх к по­звоночному столбу и далее к жаберной крышке. Вырезанный лоскут брюшной стенки удаляют, открывая доступ к внутрен­ним органам.

После вскрытия брюшной полости производят первичные посевы из внутриполостной жидкости, печени, почек, селезенки и других органов. Посевы из кишечника (если есть необходи­мость) делают в последнюю очередь.

Посевы выдерживают в термостате при температуре 24— 26 °С в течение 24—48 и более часов, в зависимости от интен­сивности роста бактерий и предполагаемого возбудителя.

Одновременно или после окончания посевов готовят мазки из поверхностных пораженных участков, крови сердца, жидко-| in брюшной полости, внутренних органов и содержимого кишечника.

Вы ".кипе чистых культур бактерий, изучение их морфо-

логических, культуралыю-биологических и других свойств про­водят по общепринятым в бактериологии методам.

В последние годы в медицинской и ветеринарной практике перед назначением лечения определяют чувствительность вы­деленных бактерий к антибиотикам. Главное управление ве­теринарии МСХ СССР 15 января 1975 г. одобрило «Временные рекомендации по определению чувствительности к левомицети-ну и хлортетрациклину бактерий, выделенных от больных крас­нухой рыб». Рекомендованный метод основан на избиратель­ном отношении к указанным антибиотикам двух родов услов­но-патогенных бактерий, выделяемых при краснухе карпов — Aeromonas и Pscudomonas.

Заключается он в следующем: от 5 рыб отбирают пробу из внутренних органов, жидкости брюшной полости и высевают в МПБ. На следующий день смесь из выросших бульонных культур высевают на чашки с МПА и растирают для образо­вания равномерного газона и накладывают диски с левомице-тином и хлортетрациклином. Выращивают при температуре 26 °С. Результат учитывают через 24 ч.

Зона задержки роста бактерий вокруг диска до 15 мм свиде­тельствует о нечувствительности их к данному антибиотику, от 15 до 20 — о чувствительности, а свыше 20 — о высокой чувствительности бактерий к антибиотику.