Описание метода реакции латексной агглютинации

Реакция коагглютинации.

 

Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка (антительный диагностикум). Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных.

В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

 Механизм основан на том, что находящийся на поверхности золотистого стафилококка белок А селективно реагирует с Fc-фрагментом IgGl, G2, G4, оставляя свободными антидетерминанты Ат, которые, взаимодействуя с гомологичным Аг, вызывают агглютинацию стафилококков.

Для постановки КОА применяют коммерческие стафилококковые реагенты, содержащиеся в ампулах или высушенные в лунках полистироловых пластин или предметных стекол. К реагенту добавляют 0,01-0,1 мл исследуемой культуры или растворимого Аг, инкубируют при комнатной температуре 10-30 мин (в условиях постановки реакции на стекле) или 18 -20 ч (в условиях постановки реакции в капиллярах).

Учет проводят так же, как при обычной РА. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе -- равномерно мутной, без осадка.

 

Реакция латекс-агглютинации

Впервые метод реакции латекс-агглютинации (РЛА) был предложен в 1956 году и использован для определения ревматоидного фактора с помощью полистирольных латексных микросфер с узким распределением частиц по размеру, покрытых гамма-глобулином человека. Сообщалось, что взаимодействие антигенов, находящихся в сыворотке крови пациента, с гамма-глобулином, адсорбированным на поверхности гидрофобных микросфер суспензии, привело к агглютинации полимерных частиц и образованию крупных агломератов, легко различимых невооруженным глазом. В последующие годы метод РЛА получил широкое распространение, как в клинических диагностических тестах, так и в биохимических и иммунологических исследованиях. Особенно широкое применение РЛА наблюдается в инфекционной патологии.

Описание метода реакции латексной агглютинации

Реакция латексной агглютинации используется в клинической химии в течение многих лет как простой, быстрый и недорогой метод определения белков, гормонов и других биологически активных соединений. Белки, являясь поливалентными антигенами, вступают в реакцию с антителами с образованием иммунных комплексов, или агглютинатов. Как правило, иммунные комплексы слабо визуализируются не только невооруженным глазом, но и с помощью фотометрических методов. Использование дисперсионных полимеров (латексов), сенсибилизированных антителами или антигенами, позволяет значительно облегчить детекцию реакции агглютинации, которая в этом случае называется реакцией латексной агглютинации. Носители для метода реакции латексной агглютинации Наиболее часто для получения диагностических препаратов используют полистирольные микросферы, несущие на своей поверхности различные функциональные группы (карбоксильные, эпоксидные, альдегидные и др.) и полиакролеиновые микросферы, содержащие на своей поверхности альдегидные функциональные группы, способные вступать в реакцию с первичными аминогруппами, образуя основание Шиффа

Применение инертных синтетических носителей для иммобилизации антител (или антигенов) является широко распространенным методическим подходом в иммуноанализе. Полимерные микросферы с узким распределением частиц по размерам и функциональными группами на поверхности представляют большой интерес для биологии и медицины, в частности для использования в качестве носителей биолигандов вместо эритроцитов при создании диагностических тест-систем на различные виды заболеваний. Замена эритроцитов на полимерные микросферы является решением проблем, связанных с недостатками эритроцитарных диагностикумов, а именно:

· 1) эритроциты получают из крови животных, содержание которых трудоемко и дорогостояще

 · 2) эритроциты содержат много антигенных детерминант, которые реагируют с компонентами сывороток человека и животных, что обуславливает протекание неспецифических реакций и приводит к ложноположительным результатам

· 3) свойства эритроцитов часто зависят от источника и способа их выделения

4) диагностикум на основе клеток одних и тех же животных не дает постоянный титр и после длительного хранения не сохраняет прежнюю степень агглютинации.

 Для замены эритроцитов, полимерные микросферы должны обладать определенными свойствами: скорость седиментации 3 – 8 мм/час, диаметр частиц порядка 5 мкм., агрегативная устойчивость в воде и буферных растворах высокой ионной силы, наличие в поверхностном слое функциональных групп, доступных для ковалентного связывания с функциональными группами белков.

 Одним из преимуществ применения полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов является возможность получения полимерных частиц с заданным комплексом свойств.

 Для устранения проблем, связанных с применением эритроцитов, используются полимерные микросферы с определенными свойствами:

 · 1) монодисперсное распределение по размерам

 · 2) сферическая форма

 · 3) устойчивость к электролитам в широком интервале pH

 · 4) способность присоединять биологические макромолекулы без значительного изменения их функциональной активности

 · 5) воспроизводимые свойства и характеристики

Однородность частиц по размерам позволяет достаточно точно определить площадь поверхности носителя и установить степень ее покрытия биолигандом, кроме того, она обусловливает сходный характер их поведения во время агглютинации, что облегчает “прочтение” результатов реакции латекс-агглютинации(РЛА).

Впервые, для создания диагностических тестсистем были использованы полистирольные микросферы. Полистирол, благодаря своей оптической прозрачности, высокой адсорбционной способности, прочности и хорошей воспроизводимости свойств, успешно используется в качестве носителя. Главной проблемой полимерных микросфер, используемых при создании диагностикумов является неспецифическая агглютинация (частицы отрицательного контроля образуют ореол из частиц вокруг центра дна лунки), причины которой и факторы ее вызывающие во многом еще не ясны. Наибольшее распространение в качестве способов уменьшения неспецифического связывания нашли значительное разбавление образцов, добавление детергентов, экранирование поверхности частиц низкомолекулярными белками. Однако применение данных методов чаще всего приводит к уменьшению чувствительности и точности реакции латексной агглютинации. При тщательной отработке методики получения латексных диагностикумов, соблюдении оптимальных условий их приготовления и постановки самой реакции, РЛА может приближаться к самым современным иммунологическим методам. РЛА сходна с РНГА по принципу сорбции антител на поверхности более крупных частиц. Преимущества метода РЛА Реакция РЛА — экспресс-метод диагностики инфекционных болезней (время проведения — до 10 мин, возможно обнаружение антигена в небольшом объёме исследуемого материала).

 Для постановки РЛА используют стеклянные или темнопольные пластины. РЛА в качестве сигнального экспресс-теста для выявления антигенов микроорганизмов удобна при использовании в практических лабораториях, а также при проведении массовых обследований.

К преимуществам РЛА, как метода серологической диагностики бактериальных и вирусных инфекций, можно отнести следующие моменты:

· - высокую специфичность и чувствительность;

· - отсутствие необходимости в сложной аппаратуре для постановки и реакции и регистрации результатов;

· - сведение до минимума количества компонентов реакции;

· - возможность получения инертных носителей с заданными характеристиками.

 Относительная дешевизна метода реакции латексной агглютинации (РЛА), простота и возможность постановки теста практически в любых условиях делают его очень удобным как при одиночных, так и при массовых исследованиях даже в небольших клинических мало оборудованных лабораториях.

Применение метода реакции латексной агглютинации РЛА применяют для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типа b(Neisseria meningitidis в СМЖ, выявлениястрептококков группы А в мазках из зева, в диагностике сальмонеллёзной инфекции, иерсиниозов и других заболеваний. Чувствительность метода — 1- 10 нг/мл (1000-1000000 бактериальных клеток в мл).

Недостаток метода — возможность получения артефактов, особенно в присутствии ревматоидных факторов и продуктов фибринолиза плексы с участием комплемента — преципитаты. Простейший пример качественной реакции преципитации — образование непрозрачной полосы преципитации в пробирке на границе наслоения антигена на иммунную сыворотку (реакция кольцепреципитации).

Реакцию преципитации проводят в гелях агара, агарозы. Их используют для выявления и изучения свойств разнообразных антигенов и антител. Материалы и реагенты для метода реакции латексной агглютинации

 · 1. Суспензия латекса. Для приготовления диагностикумов обычно используют частицы латекса диаметром 0,81…1 мкм. При применении более крупных частиц диаметром 0,22…0,3 мкм затруднен учет реакции и технологический процесс получения диагностикумов резко усложняется, а частиц более 1 мкм хотя не влияет на активность латексных диагностикумов, но существенно увеличивает частоту неспецифических реакций. Для постановки РАЛ лучше использовать очищенные латексы с гомогенными частицами правильной сферической формы. Густота суспензии латекса обычно составляет 1 %, но может достичь в отдельных случаях 1,3…1,4 %.

· 2. Буферные растворы. Для приготовления суспензии сенсибилизированных частиц латекса может быть использован изотонический раствор хлорида натрия, однако целесообразнее применять буферные растворы: трисовый (pH 7,2…8,2), триссолянокислый (pH 7,2), глициновый (pH 8,2), гликолевый, боратносолевой и др. В этом случае желательно проводить предварительную апробацию системы «латекс — буфер» в экспериментальных условиях и выбор оптимального варианта для практической работы. Иногда в процессе приготовления латексного диагностикума возникает необходимость в использовании нескольких различных буферных растворов.

 · 3. Антитела. Для сенсибилизации частиц латекса пригодны гипериммунные сыворотки, полученные при иммунизации лабораторных животных (кроликов, крыс, мышей и др.). Повышению специфичности РАЛ и уменьшению числа ложноположительных и перекрестных реакций способствует применение очищенных иммуноглобулиновых фракций.