Экзаменационный билет 11

1. Точечные мутации – мутации, затрагивающие только одну пару оснований и приводящие к замене одной пары оснований на другую. Например, пара А–Т может быть заменена Г–Ц или наоборот Мутации такого рода могут быть двух типов: • транзиции, в результате которых происходит замена пурина на другой пурин или же пиримидина на другой пиримидин (простая замена). • трансверсии, приводящие к замене пурина пиримидином, и наоборот (сложная замена), т. е. вместо пары А–Т появляется пара Т–А или Г–Ц.

миссенс-мутациями (мутациями с изменением смысла), в которых кодирующий триплет оснований после замены обеспечивает включение в белок уже другой аминокислоты. нонсенс-мутации (бессмысленные мутации), характеризующиеся тем, что кодирующий какую-либо аминокислоту триплет превращается в триплет, не кодирующий никакой аминокислоты, или стоп-кодон..

Методы молекулярно-генетического анализа

Метод молекулярной гибридизации

Этот метод используется для выявления степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов проводят сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма).

А. Исследуемую ДНК нагревают в щелочной среде для расплетения ее на две отдельные нити.

Б. Одну из них закрепляют на специальном фильтре.

В. Этот фильтр помещают в раствор, содержащий радиоактивный зонд (одноцепочечную молекулу ДНК эталонного штамма, меченную радиоактивным изотопом).

Г. Затем температуру реакционной смеси понижают, чтобы создать условия для восстановления двухцепочечной структуры ДНК.

Д. В случае, если исследуемая ДНК и ДНК эталонного штамма относятся к одному виду – в реакционной смеси формируется двухцепочечная ДНК. При отрицательной реакции двухцепочечная ДНК не формируется (для оценки реакции используется биохимическая методика). На практике все связи двух цепочек полностью не восстанавливаются из-за высокого уровня генетической изменчивости микроорганизмов, поэтому реакцию оценивают по степени гомологии – проценту восстановленных связей между двумя цепочками ДНК.

Метод - Полимеразная цепная реакция

Этот метод относится к самым современным методам исследования, без которого не мыслима ни одна крупная микробиологическая лаборатория нашего времени.

А. ПЦР можно проводить для достижения трех целей.

1. Для обнаружения в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры.

2. Для идентификации выделенных чистых культур микроорганизмов.

3. Для генотипирования микроорганизмов, т.е. определения генетических вариантов одного вида.

Б. Принцип осуществления ПЦР заключается в увеличении (амплификации) количества искомого гена при положительной или отсутствии такого увеличения при отрицательной реакции

Сначала из патологического материала или культуры микроорганизмов выделяется ДНК.

2. Затем путем нагрева в щелочной среде ДНК расплетается на две отдельные нити.

3. После этого в реакционную смесь добавляют праймеры (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого гена).

4. Реакционную смесь охлаждают.

5. Если в исследуемой ДНК имеется искомый ген, то праймеры создают фрагменты двухцепочечной ДНК, связываясь с комплементарными участками «своего» гена.

6. Затем в реакционную смесь добавляют нуклеотиды и ДНК-полимеразу.

7. Если в реакционной смеси наличествуют двухцепочечные фрагменты ДНК, то нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров, полностью достраивая соответствующий ген на всем его протяжении. А так как синтез начинался на каждой нити ДНК отдельно, то в результате получается две молекулы двухцепочечного ДНК. Другими словами, количество ДНК увеличивается в два раза.

8. Повторение циклов (от 30 до 80 раз) приводит к накоплению (амплификации) искомого гена

Метод клонирования нашел широкое применение. С его помощью

можно получать микробиологическим путем продукты, использующиеся человеком. В настоящее время разработаны методы микробиологическо-

го получения гормона инсулина, в котором нуждаются больные диабе-

том. Раньше его получали путем экстрагирования из поджелудочных же-

лез коров, свиней, что очень сложно и дорого.

Обычно содержание в клетке какого-либо сегмента ДНК, например отдельного гена, очень незначительно. Поэтому для проведения экспериментов с фрагментами ДНК их необходимо многократно копировать (клонировать). В классической методике клонирования ДНК используется способность клеток бактерий поглощать и реплицировать короткие кольцевые молекулы ДНК, известные как плазмиды. Сначала клонируемый фрагмент ДНК вырезается из исходной ДНК с помощью рестриктазы. В качестве переносчика («вектора») служит плазмида с единственным участком, узнаваемым EcoRI. Кольцевая плазмида линеаризуется с помощью EcoRI и затем смешивается с изучаемым фрагментом ДНК. Поскольку фрагмент и вектор имеют одинаковые липкие концы, некоторые из молекул будут гибридизоваться таким образом, что клонируемый фрагмент окажется интегрированным в структуру вектора. Затем концы линейной молекулы ковалентно сшиваются с помощью ДНК-лигазы с образовании новой («рекомбинантной") плазмиды. При обработке большого количества клеток некоторые из них поглощают рекомбинантную плазмиду (так называемая трансформация). Трансформированные клетки реплицируют плазмиду вместе с собственным геномом. Обычно используют плазмиды, придающие трансформированной клетке устойчивость (резистентность) к определенному антибиотику. При инкубации популяции клеток в присутствии антибиотика будут реплицироваться только те клоны, которые содержат плазмиду. Из полученного клона выделяют плазмиду и после расщепления рестриктазой EcoRI получают множество копий клонированного фрагмента ДНК.