Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток

Содержание

Введение	3
1.Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток	4
2.Соматический эмбриогенез и его механизмы	8
Заключение	21
Список интернет-источников	22

 

Введение

Биотехнология растений основана на методах культуры клеток и тканей. Культурой клеток, тканей и органов растений называется выращивание отдельных клеток, а также тканей и органов на искусственной питательной среде в асептических условиях. Этот метод лежит в основе изучения биологии клетки, существующей вне организма.

 Культура клеток высших растений может рассматриваться с трех точек зрения – как уникальная биологическая система, как модель в физиологии, биохимии и генетике растений и как инструмент для разнообразных исследований и биотехнологии.

 Популяциям растительных клеток, выращиваемым в искусственных условиях, присущи специфические особенности, благодаря которым культура клеток и тканей растений представляет новую экспериментально созданную биологическую систему. Отличия культивируемых клеток от клеток организма, часто специально усиленные путем создания биохимических мутантов, гибридных или трансформированных клеток, помогают глубже проникнуть в механизмы процессов, происходящих в растении.

 В качестве биологической модели клетки in vitro представляют интерес для многих физиологов и биохимиков растений, а также генетиков. Однако степень адекватности такой модели зависит от изучаемого процесса. Культура клеток, как правило, является адекватной моделью для тех процессов, которые протекают в любой растительной клетке, независимо от существующих систем контроля. Для тех клеточных функций, где принципиальную роль играют механизмы организменного контроля развития, модель может быть неадекватной.

 Культура клеток растений широко используется в самых разнообразных фундаментальных и прикладных исследованиях. На основе культивируемых клеток и тканей высших растений в настоящее время созданы и активно развиваются перспективные, принципиально новые технологии для различных отраслей промышленности и сельского хозяйства.

 

Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток

Получение культуры отдельных изолированных клеток очень ценно для генетических и физиологических исследований, практического использования в клеточной селекции. Так, получение клона потомства одиночной клетки помогает установить причины генетической неоднородности каллусных клеток.

Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, тканей растений, из каллусных тканей или культуры протопластов после восстановления клеточной стенки. Для получения одиночных клеток иногда достаточно отстаивания суспензионной культуры (10-15 мин в колбе) или использования мацерирующих ферментов, центрифугирования в градиенте сахарозы либо фильтрования через сито.

 Первые работы по изоляции клеток растений и получению изолированных клонов было выполнено в 1954 г. в Висконсинском университете, США. Отдельные клетки выделяли из рыхлой каллусной ткани табака, культивированной в жидкой питательной среде при постоянном встряхивании на шейке-ре. Трудности связаны с тем, что отдельные клетки не делятся в тех условиях, при которых растет каллусная ткань. Предварительные эксперименты показали, что при помещении отдельной изолированной клетки в культуральную среду ее деления не происходило.

Однако клоны из таких клеток удалось получить Мьюиру с соавторами с использованием метода ткани - «няньки». В этом случае изолированную клетку переносили на фильтровальную бумагу, смоченную питательной средой и помещенную на поверхность хорошо растущей каллусной ткани.

 Каллусная ткань индуцировала и поддерживала деление клетки, а затем и развитие клеточного клона. В тех же целях используют суспензионные культуры клеток (рис. 1).

Метод кормящего слоя близок к методу культуры-няньки. В качестве кормящего слоя используют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка. Другой вариант культивирования одиночных клеток на основе выделений из делящихся клеток - кондиционирование среды. В этом случае клеточную суспензию в экспоненциальной фазе фильтруют через бактериальный фильтр, после чего фильтрат (среду с выделениями клеток суспензии) добавляют в среду для культивирования одиночных клеток.

Для индукции клеточных делений одиночных клеток можно использовать кормящий слой (активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений), отделенный от культивируемых одиночных клеток полупроницаемой мембраной.

 Стимулирует клеточное деление и кондиционирование среды, для чего в нее добавляют питательную среду интенсивно делящейся культуры клеток. Кондиционирующий фактор получают при фильтровании клеточной суспензии в экспоненциальной фазе роста через бактериальный фильтр.

Позже был разработан метод массового культивирования отдельных изолированных клеток - метод плейтинга (от the plate - чашка).

Метод состоит из следующих процедур:

 - получение клеточной суспензии в жидкой питательной среде из хорошо растущей каллусной ткани;

 - фильтрование суспензии через сито для удаления крупных клеточных агрегатов;

- приготовление 0,6-1 %-й агаровой среды того же состава, который был использован для поддержания роста суспензии;

- нагревание агаровой среды до жидкого состояния и перемешивание ее с равным количеством суспензии, которую необходимо разлить в чашки Петри слоем около 1 мм;

- определение местоположения отдельных клеток с использованием инвертированного микроскопа и нанесение пометок об их наличии на крышках чашек;

 - культивирование в темноте при t = 25 °С;

 - наблюдения за развитием одноклеточных клонов.

 В экспериментах Бергмана около 20 % изолированных каллусных клеток табака делилось и образовывало колонии.

 При данном способе культивирования, даже при недостаточно сбалансированном составе питательной среды, может происходить деление отдельных клеток. Это обусловлено тем, что в соседних колониях, образованных из мелких клеточных агрегатов, синтезируются ростовые вещества, которые выделяются в среду и стимулируют клеточное деление.

Метод микрокамеры разработан Джонсом в 1960 г., который может быть использован при оптимальной сбалансированности состава питательной среды для культивирования отдельной изолированной клетки.

Метод включает следующие процедуры:

 - на предметное стекло с помощью парафинового масла на небольшом расстоянии наклеивают два покровных стекла;

 - между покровными стеклами наносят квадрат из парафинового масла;

- в камеру из парафинового масла помещают каплю питательной среды с изолированной клеткой;

 - сверху камеру накрывают третьим покровным стеклом;

 - за развитием клеточной колонии наблюдают под микроскопом.

Использование микрокамеры Джонса позволило Вэсилу и Хильдебрандту в 1965 г. продемонстрировать возможность получения из изолированной клетки табака нормально развивающегося и достигшего цветения растения. Таким образом, впервые экспериментально была доказана тотипотентность клетки растения. К указанному методу близок способ Ю.Ю. Глеба – в микрокаплях.

Метод микрокапель основан на асептическом культивировании одиночных клеток в капле жидкой среды, окруженной стерильным минеральным маслом в специально сконструированных микрокамерах.

Метод пластинок – реплик. На чашку, посеянную методом плейтинга, наносят капроновую сетку, чтобы она находилась в контакте с агаризованной средой. Клетки прорастают через нити сетки и прилипают к ней. Через 20 дней контакта сетку переносят на новую чашку Петри обратной стороной. При этом на новой чашке копируется расположение клеточных клонов.