2020-10-10
2410
Работа 6.Отбор почвенной пробы и подготовка образца к анализу
Микроорганизмы играют важную роль в процессе формирования почвы. Численность микроорганизмов в почве во многом определяет ее плодородие. Изучение микроорганизмов почвы дает надежные результаты лишь в том случае, если правильно взяты почвенные образцы. До взятия почвенных образцов следует сделать описание района исследования, указав характер рельефа, растительность и агротехнику. Необходимо дать подробную характеристику почв.
При исследовании микроорганизмов в почвенных горизонтах делают почвенный разрез. Вертикальную стенку почвенного разреза зачищают каждый раз перед взятием образцов почвы. При изучении микрофлоры участка определенной площади готовят смешанные образцы почвы, отбирая пробы по диагонали участка на определенной глубине от поверхности. Микроорганизмы в почве распространены неравномерно, поэтому важно анализировать большое число почвенных образцов. По Н. А. Красильникову, рекомендуется на участке площадью 100 м2 анализировать три образца почвы, каждый из которых состоит из трех проб.
Почвенные образцы берут в стерильные пергаментные пакеты или стеклянные банки, закрытые ватно-марлевыми пробками. Для отбора почвенных образцов удобно использовать металлические совки, садовые ножи или небольшие лопаты, иногда почвенный бур.
Оборудование протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и обжигают на пламени. Для количественного учета почвенных микроорганизмов и грубого качественного анализа допустимо совки и ножи обтирать многократным втыканием их в исследуемый почвенный горизонт.
Каждый образец почвы сопровождают этикеткой, где указывают дату взятия образца, район участка и горизонт.
Для взятия пробы почвы стерильным ножом снимают верхний слой почвы (1,5—2,0 см), который может быть загрязнен посторонней микрофлорой. Далее совком или лопатой берут 100—200 г почвы и насыпают в пакет или банку.
При изучении микроорганизмов пахотных почв образцы берут на всю глубину пахотного слоя. При изучении микроорганизмов на разной глубине пробы почвы берут по генетическим горизонтам из почвенного разреза. В горизонте делают нишу и из нее извлекают почвенную пробу, начиная с нижнего горизонта к верхнему.
Почвенные образцы желательно анализировать в тот же день, так как количество микроорганизмов в них может изменяться. Если почвенные образцы невозможно проанализировать в тот же день, рекомендуется высушить образцы почвы при 30°С. Однако следует иметь в виду, что в сухих образцах численность микроорганизмов резко падает и соотношение отдельных физиологических групп микроорганизмов значительно меняется.
Работа 7. Выделение и количественный учет микроорганизмов почвы на твердых питательных средах
Общее количество микроорганизмов в почве свидетельствует об интенсивности биохимических процессов, протекающих в почве и определяющих накопление элементов корневого питания растений. Количество микроорганизмов в почве определяют методом посева почвенной суспензии на питательные среды либо прямым микроскопическим счетом клеток на препаратах.
Метод посева почвенной суспензии на твердые питательные среды (МПА, КАА, среду Эшби, среду Чапека) позволяет учесть общее количество микроорганизмов и получить на пластинке с агаром изолированные колонии для выделения микроорганизмов в чистую культуру.
Микроорганизмы, выделенные в чистую культуру, в дальнейшем могут быть всесторонне изучены и идентифицированы. В этом прежде всего заключается ценность этого метода. Однако в лабораторной практике микробиологии нет универсальной питательной среды, на которой развивались бы все почвенные микроорганизмы. Даже применение наиболее универсальных питательных сред позволяет учесть лишь незначительную часть микронаселения почвы (0,1—1,0%).
Сущность метода заключается в нанесении почвенной суспензии микроорганизмов на поверхность твердой питательной среды. Количество микроорганизмов определяют по числу развившихся колоний, учитывая, что одна микробная клетка дает начало одной колонии. Таким образом, метод позволяет учесть лишь микроорганизмы, способные развиться на данной питательной среде, результаты же общей численности микроорганизмов получаются заниженные.
Материалы и оборудование
Весы, разновесы, часовое стекло, скальпель, ступка, резиновая перчатка, колба со стерильной дистиллированной водой, пипетки на 10 мл и 1 мл, микропипетки на 0,1 мл, пробирки, колба объемом 250 мл, колба с питательной средой, чашки Петри, стеклянные шпатели.
Ход работы
Приготовление почвенной суспензии Для приготовления разведений почвенной суспензий готовят ряд пробирок с 9 мл стерильной дистиллированной воды, колбу, содержащую 90 мл стерильной воды, и вторую колбу, стерильную, сухую, объемом 250 мл.
Для диспергирования почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с поверхности почвенных частиц почву обрабатывают ультразвуком (установка УЗДН-1, 15 кГц,0,ЗА), растирают или встряхивают на пропеллерной мешалке. Такая предварительная обработка почвы позволяет учесть значительно большее количество микроорганизмов (Мишустин, 1975). Наиболее доступным приемом предварительной обработки почвы, дающим хорошие результаты, считается растирание почвенного образца.
Исследуемую почву высыпают на стерильное стекло. Стекло заранее протирают спиртом и обжигают на пламени. Почву тщательно перемешивают шпателем, удаляя механические частицы и корни растений. Соблюдая стерильность, на часовом стекле отвешивают 10 г. почвы и переносят ее в стерильную ступку.
Навеску почвы в ступке увлажняют до пастообразного состояния, добавляя 2—3 мл воды из первой колбы, содержащей 90 мл стерильной воды, и растирают 5 мин пальцем в резиновой перчатке. После растирания почву из ступки переносят с помощью воды во вторую сухую колбу, получают первое разведение - 1/10.
Почвенную суспензию в колбе встряхивают в течение 5 мин, дают отстояться 30 с и далее стерильной пипеткой переносят 1 мл почвенной суспензии из колбы в пробирку ¹ 1 с 9 мл стерильной дистиллированной воды, получают второе разведение—1/100. Подобным образом готовят ряд последующих разведений почвенной суспензии—1/1000, 1/10000, 1/100000 и более в зависимости от предполагаемой численности микроорганизмов, учитывая тип почвы, генетический горизонт, сезон года,
350 колоний 70 колоний 12колоний
Рис. 17. Схема приготовления разведений и высева почвенной суспензии на твердые питательные среды.
влажность почвенной пробы и т.д. Для приготовления каждого нового разведения почвенной суспензии следует пользоваться новой стерильной пипеткой (рис. 17).
Посев. Для выделения и количественного учета бактерий почвенную суспензию высевают на одну из питательных сред МПА, КАА, почвенный агар, среду Эшби; для учета актиномицетов используют КАА или среду Чапека; для выделения и количественного учета грибов и дрожжей применяют СА или модифицированную среду Чапека.
Питательную среду, расплавленную на водяной бане, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри слоем 0,5—0,8 см. Для высева на каждое разведение почвенной суспензии готовят по 3—5 чашек Петри. После застывания среды для удаления капель воды с крышек и появления муаровой поверхности на агаре чашки Петри подсушивают в термостате при температуре 60—70°С. На крышке чашки Петри пишут этикетку, указывая номер почвенной пробы, дату посева, разведение и повторность.
Для выделения почвенных микроорганизмов обычно проводят поверхностный посев почвенной суспензии на питательную среду. Предварительно до посева отбирают пипетки на 1 мл с одинаковым числом капель жидкости, так как размер капель из разных пипеток может отличаться, что приведет к ошибке в подсчете микроорганизмов. На каждое новое разведение почвенной суспензии следует приготовить новую стерильную пипетку и новый стерильный шпатель.
Стерильной пипеткой на 1 мл наносят каплю почвенной суспензии из соответствующего разведения по центру питательной среды в чашке Петри и тщательно растирают ее стеклянным шпателем по всей поверхности агаровой пластинки. Для посева почвенной суспензии удобно пользоваться микропипетками на 0,1—0,2 мл. Засеянные чашки Петри переворачивают средой вверх и помещают в термостат при температуре 28—30°С.
Колонии бактерий на чашках Петри подсчитывают через 3—5 суток, грибов и дрожжей—через 5—7, актиномицетов— через 7—15. Наиболее точный результат получается при развитии на чашке Петри 50—200 колоний бактерий и актиномицетов и 30—50 колоний грибов. Следует иметь в виду, что при очень большом и очень малом количестве колоний на чашках Петри могут быть значительные ошибки при подсчете микроорганизмов. Обычно почвенную суспензию высевают из 3—4 последовательных разведений на 3—5 чашек Петри из каждого разведения. Для учета грибов почвенную суспензию высевают из разведений на 1—2 порядка ниже, чем для учета бактерий и актиномицетов.
Подсчет колоний микроорганизмов на чашках Петри Для удобства подсчета колоний микроорганизмов дно чашки Петри разделяют тушью или чернильной пастой на секторы или сегменты. Если питательная среда прозрачна, колонии подсчитывают в проходящем свете со дна чашки; в случае непрозрачной питательной среды колонии микроорганизмов подсчитывают непосредственно с поверхности агара. Учтенные колонии отмечают точками на стекле. Для подсчета мелких колоний пользуются ручной лупой. Чашки Петри, в которых развилась масса колоний микроорганизмов, обрабатывают специальным прибором для счета микробных колоний, выпускаемым медицинской промышленностью СССР.
Подсчитав число колоний микроорганизмов, развившихся на чашках Петри по всем повторностям соответствующего разведения, определяют средние число колоний на чашке и далее пересчитывают количество микроорганизмов на 1 г. воздушно-сухой почвы по формуле:
а = б´в´г
д
где а — число клеток микроорганизмов в 1 г. воздушно-сухой почвы, б — среднее число колоний микроорганизмов на чашке Петри, в — соответствующее разведение, г — количество капель в 1 мл жидкости в пипетке, д — навеска почвы, взятой для анализа.
Для большей точности учета численности микроорганизмов параллельно микробиологическому анализу определяют процент влажности почвенной пробы и окончательное количество микроорганизмов рассчитывают на 1 г абсолютно сухой почвы.
Работа 8. Количественный учет микроорганизмов почвы методом предельных разведений на жидких питательных средах
Метод предельных разведений обычно используют при групповом анализе почвенных микроорганизмов для количественного определения аммонификаторов, нитрификаторов, денитрификаторов, клетчаткоразрушающих бактерий и др. Данный метод требует особо тщательного соблюдения правил стерильности как при приготовлении разведений почвенной суспензии, так и при посеве суспензии на питательные среды, так как каждая случайно занесенная клетка может привести сразу к значительной ошибке в численности микроорганизмов.
Материалы и оборудование
Весы, разновесы, часовое стекло, скальпель, ступка, резиновая перчатка, колба со стерильной дистиллированной водой, пипетки на 10 мл и 1 мл, пробирки, две колбы объемом 250 мл, питательная среда.
Ход работы
Для количественного учета микроорганизмов методом предельных разведений на жидких питательных средах навеску исследуемой почвы подвергают растиранию в ступке, а затем готовят ряд последовательных разведений почвенной суспензии точно так же, как при посеве на твердые питательные среды (см. работу 23).
Приготовленную почвенную суспензию высевают в пробирки или колбы с питательной средой, соответствующей данной физиологической группе микроорганизмов. Так, для количественного учета аммонификаторов обычно пользуются пептонной водой, учета нитрификаторов—средой Виноградского, учета денитрификаторов—средой Гильтэя, учета клетчаткоразрушающих аэробов—средой Гетчинсона, учета клетчаткоразрушающих анаэробов—средой Имшенецкого, для учета маслянокислых бактерий—средой Виноградского. Состав и приготовление питательных сред приведены в работах при изучении микроорганизмов отдельных физиологических групп.
Для учета микроорганизмов, характеризующихся высокой численностью (аммонификаторы, денитрификаторы, маслянокислые бактерии), почвенную суспензию рекомендуется высевать из разведений 1/1000 и выше; для учета микроорганизмов, сравнительно мало распространенных (нитрификаторы, клетчаткоразрушающие бактерии), посев почвенной суспензии проводят из первых 2—4 разведений—1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000. В каждую пробирку или колбу с питательной средой стерильной пипеткой высевают по 1 мл почвенной суспензии из соответствующего разведения. Суспензией каждого разведения засевают 3—5 пробирок или колб.
Засеянные пробирки или колбы помещают в термостат для инкубации при температуре, оптимальной для данной физиологической группы микроорганизмов.
Количество микроорганизмов, развившихся на питательных средах, определяют по таблице Мак-Креди, составленной на основании методов вариационной статистики.
Для определения числа микроорганизмов в засеянных пробирках или колбах составляют так называемую числовую характеристику. Она состоит из трех цифр. Первая цифра соответствует числу пробирок последнего разведения, в котором еще обнаруживается рост микроорганизмов в пробирках всех повторностей. Следующие две цифры обозначают число пробирок с ростом микроорганизмов в двух последующих разведениях. Если рост микроорганизмов обнаружен более чем в двух последующих разведениях, число этих пробирок прибавляют к последней цифре.
По трехзначной числовой характеристике в таблице Мак-Креди находят вероятное число микроорганизмов в 1 мл разведения, принятого за первую цифру числовой характеристики. Умножив это вероятное число микроорганизмов на соответствующее разведение, получают количество клеток микроорганизмов в 1 г. исследуемой почвы. Для большей точности получаемых результатов содержание клеток микроорганизмов пересчитывают на 1 г. абсолютно сухой почвы, учитывая процент влажности почвы.
Пример 1
| Разведение | 1/10 | 1/100 | 1/1000 | 1/10000 | 1/100000 |
| Число засеянных пробирок | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| Число пробирок, в которых обнаружен рост бактерий | 3 | 3 | 2 | 2 | 0 |
| Числовая характеристика — 321.
| |||||
Вероятное число микроорганизмов по таблице Мак-Креди — 15,0.
Число микроорганизмов в 1 г. воздушно-сухой почвы: 15´100 = 1500.
Пример 2
| Разведение | 1/10 | 1/100 | 1/1000 | 1/10000 | 1/100000 | 1/1000000 |
| Число засеянных пробирок | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Число пробирок, в которых обнаружен рост бактерий | 5 | 5 | 5 | 0 | 1 | 1 |
| Числовая характеристика — 502
| ||||||
Вероятное число микроорганизмов по таблице Мак-Креди — 4,0.
Число микроорганизмов в 1 г. воздушно-сухой почвы: 4 ´ 1000 =4000.
Приводим таблицу Мак-Креди для быстрой обработки результатов учета микробов по методу предельных разведений
| Числовая характеристика | Наиболее вероятное число микробов при заражении сред в параллельных пробирках | Числовая характеристика | Наиболее вероятное число микробов при заражении сред в параллельных пробирках | ||||||||||||||
| 2 | 3 | 4 | б |
| 2 | 3 | 4 | 5 | |||||||||
| 000 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 141 | -- | -- | 1,7 | -- | ||||||||
| 001 | 0,5 | 0,3 | 0,2 | 0,2 | 200 | 2,5 | 0,9 | 0,6 | 0.5 | ||||||||
| 002 | -- | -- | 0,5 | 0,4 | 201 | 5,0 | 1,4 | 0,9 | 0,7 | ||||||||
| 003 | -- | -- | 0,7 | -- | 202 | -- | 2,0 | 1,2 | 0,9 | ||||||||
| 010 | 0,5 | 0,3 | 0,2 | 0,2 | 203 | -- | -- | 1,6 | 1,2 | ||||||||
| 011 | 0,9 | 0,6 | 0,5 | 0,4 | 210 | 6,0 | 1,5 | 0,9 | 0,7 | ||||||||
| 012 | -- | -- | 0,7 | 0,6 | 211 | 13,0 | 2,0 | 1,3 | 0,9 | ||||||||
| 013 | -- | -- | 0,9 | -- | 212 | 20,0 | 3,0 | 1,6 | 1,2 | ||||||||
| 020 | 0,9 | 0,6 | 0,5 | 0,4 | 213 | -- | -- | 2,0 | -- | ||||||||
| 021 | -- | -- | 0,7 | 0,6 | 220 | 25,0 | 2,0 | 1,3 | 0,9 | ||||||||
| 022 | -- | -- | 0,9 | -- | 221 | 70,0 | 3,0 | 1,6 | 1,2 | ||||||||
| 030 | -- | -- | 0,7 | 0,6 | 222 | 110,0 | 3,5 | 2,0 | 1,4 | ||||||||
| 031 | -- | -- | 0,9 | -- | 223 | -- | 4,0 | -- | -- | ||||||||
| 040 | -- | -- | 0,9 | -- | 230 | -- | 3.0 | 1,7 | 1,2 | ||||||||
| 041 | -- | -- | 1,2 | -- | 231 | -- | 3,5 | 2,0 | 1,4 | ||||||||
| 100 | 0,6 | 0,4 | 0,3 | 0,2 | 232 | -- | 0,4- | -- | -- | ||||||||
| 101 | 1,2 | 0,7 | 0,5 | 0,4 | 240 | -- | -- | 2,0 | 1,4 | ||||||||
| 102 | -- | 1,1 | 0,8 | 0,6 | 241 | -- | -- | 3,0 | -- | ||||||||
| 103 | -- | -- | 1,0 | 0,8 | 300 | -- | 2,5 | 1,1 | 0,8 | ||||||||
| 110 | 1,3 | 0,7 | 0,5 | 0,4 | 301 | -- | 4,0 | 1.6 | 1,1 | ||||||||
| 111 | 2,0 | 1,1 | 0,8 | 0,6 | 302 | -- | 6,5 | 2,0 | 1,4 | ||||||||
| 112 | -- | -- | 1,1 | 0,8 | 303 | -- | -- | 2,5 | -- | ||||||||
| 113 | -- | -- | 1,3 | -- | 310 | -- | 4,5 | 1,6 | 1,1 | ||||||||
| 120 | 2,0 | 1,1 | 0,8 | 0,6 | 311 | -- | 7,5 | 2,0 | 1,4 | ||||||||
| 121 | 3,0 | 1,5 | 1,1 | 0,8 | 312 | -- | 11,5 | 3,0 | 1,7 | ||||||||
| 122 | -- | -- | 1,3 | 1,0 | 313 | -- | 16,0 | 3,5 | 2,0 | ||||||||
| 123 | -- | --, | 1.6 | -- | 320 | -- | 9,5 | 2,0 | 1,4 | ||||||||
| 130 | -- | 1,6 | 1,1 | 0,8 | 321 | -- | 15,0 | 3,0 | 1,7 | ||||||||
| 131 | -- | -- | 1,4 | 1,0 | 322 | -- | 20,0 | 3,5 | 2,0 | ||||||||
| 132 | -- | -- | 1,6 | -- | 323 | .-- | 30,0 | -- | -- | ||||||||
| 140 | -- | -- | 1,4 | 1,1 | 330 | -- | 25,0 | 3,0 | 1,7 | ||||||||
| 331 | -- | 45,0 | 3.5 | 2,0 | 500 | -- | -- | -- | 2,5 | ||||||||
| 332 | -- | 110,0 | 4,0 | -- | 501 | -- | -- | -- | 3,0 | ||||||||
| 333 | -- | 140,0 | 5,0 | -- | 502 | -- | -- | -- | 4,0 | ||||||||
| 340 | -- | -- | 3,5 | 2,0 | 503 | -- | -- | -- | 6,0 | ||||||||
| 341 | -- | -- | 4,5 | 2,5 | 504 | -- | -- | -- | 7,5 | ||||||||
| 350 | -- | -- | -- | 2,5 | 510 | -- | -- | -- | 3,5 | ||||||||
| 400 | -- | -- | 2,5 | 1,3 | 511 | -- | -- | -- | 4,5 | ||||||||
| 401 | -- | -- | 3,5 | 1,7 | 512 | -- | -- | --. | 6,0 | ||||||||
| 402 | -- | -- | 5,0 | 2,0 | 513 | -- | -- | -- | 8,5 | ||||||||
| 403 | -- | -- | 7,0 | 2,5 | 520 | -- | -- | -- | 5,0 | ||||||||
| 410 | -- | -- | 3,5 | 1,7 | 521 | -- | -- | -- | 7,0 | ||||||||
| 411 | -- | -- | 5,5 | 2,0 | 522 | -- | -- | -- | 9,5 | ||||||||
| 412 | -- | -- | 8,0 | 2,5 | 523 | -- | -- | -- | 12,0 | ||||||||
| 413 | -- | -- | 11,0 | -- | 524 | -- | -- | -- | 15,0 | ||||||||
| 414 | -- | -- | 14,0 | -- | 525 | -- | -- | -- | 17,5 | ||||||||
| 420 | -- | -- | 6.0 | 2,0 | 530 | -- | -- | -- | 8,0 | ||||||||
| 421 | — | — | 9,5 | 2,5 | 531 | — | — | — | 11,0 | ||||||||
| 422 | -- | -- | 13,0 | 3,0 | 532 | -- | -- | -- | 14,0 | ||||||||
| 423 | — | — | 17,0 | — | 533 | --- | — | — | 17,5 | ||||||||
| 424 | — | — | 20,0 | — | 534 | — | — | — | 20,0 | ||||||||
| 430 | — | — | 11,5 | 2,5 | 535 | — | — | — | 25,0 | ||||||||
| 431 | — | — | 16,5 | 3,0 | 540 | — | — | — | 13,0 | ||||||||
| 432 | — | — | 20,0 | 4.0 | 541 | — | — | — | 17,0 | ||||||||
| 433 | — | — | 30,0 | — | 542 | — | — | --- | 25,0 | ||||||||
| 434 | — | — | 35,0 | — | 543 | — | — | --- | 30,0 | ||||||||
| 440 | — | — | 25,0 | 3,5 | 544 | — | — | --- | 35,0 | ||||||||
| 441 | — | — | 40,0 | 4,0 | 545 | — | — | — | 45,0 | ||||||||
| 442 | — | — | 70,0 | — | 550 | — | — | --- | 25,0 | ||||||||
| 443 | — | — | 140,0 | — | 551- | — | — | --- | 35,0 | ||||||||
| 444 | — | — | 160,0 | — | 552 | — | — | --- | 60,0 | ||||||||
| 450 | — | — | — | 4,0 | 553 | — | — | — | 90,0 | ||||||||
| 451 | --- | — | — | 5,0 | 554 | — | — | --- | 100,0 | ||||||||
|
| 555 | --- | --- | --- | 180,0 | ||||||||||||
Работа 9. Качественно – количественный учет микрофлоры почвы методом Д. М. Новогрудского
Микроорганизмы своей жизнедеятельностью в значительной мере влияют на почвообразовательные процессы, создавая условия для развития тех или иных биогеоценозов. Изучение микроорганизмов почвы является составной частью геоботанических исследований.
Для определения общего количества микроорганизмов в почве рекомендуется метод высева почвенного мелкозема на агаризованную воду по Д. М. Новогрудскому. Метод успешно используют для получения сравнительных данных о заселенности микроорганизмами различных почв с учетом почвенного горизонта, времени года, растения-эдификатора, ризосферной зоны, а также для выяснения соотношения отдельных групп микроорганизмов: бактерий, плесневых грибов и актиномицетов в почве.
Метод основан на высеве строго определенной навески почвенного мелкозема на агаризованную воду. Учетным элементом является почвенная частичка. Она естественный источник выделения микроорганизмов и одновременно природный субстрат. Ввиду крайней бедности среды рост микроорганизмов идет лишь в водной пленке вокруг почвенной частички, исключая плесневые грибы, способные образовывать свои водные пленки и разрастаться на поверхности агара.
