Выделение и идентификация патогенных видов рода Actinomyces

Микроскопическое исследование исходного материала

Объектом исследования является гной, экссудат, содержимое абсцессов, пораженные лимфатические узлы. Тканевый материал в случае необхо­димости консервируют в 30%-ном водном растворе глицерина.

Бактериологическое исследование

При диагностике болезней, вызываемых A.bovis и A.viscosus, существен­ное диагностическое значение имеет микроскопия зернистых гранул «друз», обнаруживаемых в гное или экссудате. С указанной целью гной (экссудат) помещают в чашку Петри, разводят небольшим количеством дистиллированной воды, находят зеленовато-желтые (A.bovis) или серо-белые (A.viscosus) зернышки, т.н. «друзы». Зернышки промывают в дис­тиллированной воде, помещают на предметное стекло в каплю 10-20%-ного раствора NaOH или КОН и выдерживают 15 минут или не­много подогревают над пламенем горелки. Далее на препарат наносят водный раствор глицерина (50%-ный), накрывают его покровным стек­лом и изучают под малым и большим увеличением микроскопа. Скопле­ния клеток возбудителя имеют гомогенный центр из переплетенных па­лочковидных клеток, к периферии булавовидно утолщающихся. При ок­раске по Граму центр «друзы» окрашивается грамположительно, пери­ферия — грамотрицателыю.

В препаратах, содержащих в материале A.pyogenes, находят малень­кие, очень полиморфные грамположительные палочковидные бактерии раз­мером 0,5-2,0 х 0,2-0,3 мкм, располагающиеся беспорядочно. Клетки A.hordieovulneris имеют морфологию, типичную для рода, — нитевидные ветвящиеся, реже короткие дифтероидные формы.

Культивирование. Посев исследуемого материала производят на кровяной агар (кровь овец, крупного рогатого скота). Посевы материала, предположительно со­держащего A.bovis, культивируют в аэробных условиях в атмосфере 10%) СО₂; A.hordeovulneris растет в аэробных и анаэробных условиях с содержа­нием в атмосфере 10%> CO₂ A.pyogenes и
A. Viscosus растут в аэробных усло­виях с 10%) СО₂. Контаминированный материал высевают на селективные среды (см. «Питательные среды»). Для выделе­ния A.israelii из контаминированного материала на неселективных средах следующую его предварительную обработку. Материал суспендируют в транспортной среде Syed: раствор 1-0,6% раствор К₂НР0₄, раствор 2-1,2% раствор NaCl, 1,2% раствор (NH₄) ₂S0₄, 0,6% раствор КН₂Р0₄, 0,25% раствор MgS0₄. Готовая среда содержит 75 мл раствора №1, 75 мл раствора № 2,10 мл 1М раствора этилендиаминотетраацетата, 20 мл свежего 1%-ного раство­ра дитиотреитола, 5 мл 8%-ного раствора Na₂C0₃, 1 мл 1%>-ного раствора резазурина, 814 мл дистиллированной воды, рН 8,0. Среду стерилизуют фильтрацией. Исследуемый материал суспендируют в транспортной сре­де. 1 мл суспензии смешивают с 1 мл толуола и встряхивают 20 минут. Водную фазу отсасывают пипеткой, добавляют к ней 10 мл транспортной среды, центрифугируют и осадок высевают на неселективные питатель­ные среды.

Эффект обработки основан на ингибирующем действии толуола на грамотрицательные бактерии. Посевы культивируют при 36-37° С от 2-4 до 14 дней.

Особенности роста актииомицетов на питательных средах. A.bovis на плотных питательных средах образует нитевидные микроко­лонии через 24 часа; позднее — макроколонии диаметром около 2 мм, не­прозрачные, белые, серо-белые, кремово-белые, шероховатые или гладкие, без зоны гемолиза, мягкой консистенции. Рост медленный, типичные коло­нии формируются к 14-15 дню культивирования. Возбудитель хорошо растет (диффузно) в тиогликолатном бульоне к 7-10 дню инкубирования.

A.pyogenes. Нитевидных микроколоний не образует, через 48 часов ин­кубирования формирует колонии размером около 1 мм с узкой зоной
β-гемолиза, выпуклые, с ровными краями, непрозрачные, белые или серо-белые, гладкие, мягкой консистенции.

A. viscosus формирует колонии двух типов: 1-й тип — крупные, гладкие, бле­стящие, выпуклые; 2-й тип — маленькие, шероховатые, неправильной формы.

A.hordeovulneris. Первоначально образует нитевидные микроколонии, позднее (14 дней культивирования) формируются колонии размером около 2 мм, приподнятые, с волнистым краем, с нитевидными отростками, непрозрачные, белые, серо-белые, кремово-белые, шероховатые, сухие или мяг­кой консистенции, обычно без зоны гемолиза.

A.suis. Образует колонии размером до 2 мм, гладкие, непрозрачные, вы­пуклые, центр может иметь углубление, края волнистые с отростками, бе­лого или серо-белого цвета. Колонии могут быть шероховатыми или глад­кими, сухими или мягкими.

A.israelii. Образует нитевидные микроколонии на плотных средах, к 14 дню - макроколонии R- формы, диаметром около 2 мм, выпуклые, центр может иметь углубление, края волнообразные и нитевидные, непрозрач­ные, белого, серо-белого, кремово-белого цвета, по консистенции сухие, крошкообразные или мягкие.

Морфология клеток актиномицетов в культуре. Морфология клеток в культуре у ряда актиномицетов отличается от таковой в исследуемом материале.

A bovis. В препаратах, окрашенных по Граму, клетки имеют фор­му грамположительных палочек, коккобактерий, палочек с утолщен­ными или разветвляющимися концами, могут присутствовать нити раз­личной длины.

A.pyogenes. В препаратах находят типичные для рода полиморфные грамположительные палочки.

A. viscosus. В мазках из крупных колоний обнаруживают грамположи-тельные дифтероидные палочковидные клетки, в мелких колониях — ко­роткие ветвящиеся нити.

A hordeovulneris. Морфология клеток в препаратах типична для рода. A.suis. В препаратах находят типичные грамположительные палочки дифтероидной формы, иногда кокковидной, а также V, Y или Т-формы, ко­роткие или длинные нити, ветвящиеся формы.

Идентификация представителей рода Actinomyces на уровне рода. Начальные этапы идентификации предполагают в первую очередь диф­ференциацию видов рода Actinomyces от родов Nocardia, Streptomyces, Dermatophilus. При этом у выделенных культур определяют: потребность в О каталазную активность, подвижность, кислотоустойчивость клеток, рост на грибных средах, наличие воздушных гиф, образование спор, фрагмен­тацию гиф наличие запаха у колоний, тип утилизации углеводов (оксида­ция, ферментация в тесте Хью - Ляйфсона).

На основании перечисленных признаков для дальнейшего изучения от­бирают культуры бактерий, типичные по морфологическим, тинкториаль-ным и культуральным свойствам для Actinomyces, растущие в анаэробных или капнофильных (СО₂) условиях атмосферы, не имеющие запаха, дающие отрицательную (чаще) или положительную (реже) реакцию на каталазу, не проявляющие при окраске по модифицированному методу Циля — Нильсе­на кислотоустойчивое™, не растущие на средах для культивирования гри бов, не образующие воздушных гиф, спор, не проявляющие склонности к фрагментации нитей (гиф), расщепляющие углеводы (глюкоза) в тесте Хью — Ляйфсона путем ферментации.