Рестриктазы класса II

Можно выделить в индивидуальном состоянии, свободном от метилазной активности, что упрощает их изучение и использование. Состоят из двух субъединиц одного типа со сравнительно небольшой молекулярной массой.

Субстрат: немодифицированная двухцепочечная ДНК.

Кофактор: Mg²⁺

Узнаваемая последовательность: палиндромная структура (4-8 пн)

Палиндром это последовательность- перевертыш, идентичная в обеих цепях при прочтении в направлении от 5' к 3'. Палиндромные последовательности, которые узнаются рестриктазами класса II и в которых происходит расщепление ДНК, называются сайтами узнавания. Участки полинуклеотидной цепи, в которых происходит разрезание молекулы ДНК, называются сайтами рестрикции. Для Eco RI сайт узнавания – GAATТC, сайт рестрикции – GA. Расщепляется связь между атомами кислорода при 3' атоме углерода в дезоксирибозе одного нуклеотида и фосфатной группой, присоединной к 5' углеродному атому сахара другого нуклеотида.

Ряд рестриктаз расщепляет ДНК строго по оси симметрии узнаваемой последовательности и образует фрагменты ДНК с тупыми концами, то есть не имеющие выступающих одноцепочечных участков.

Если же разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате образуются одноцепочные комплементарные концы, называемые липкими концами. При смешивании разных препаратов таких фрагментов ДНК в определенных условиях липкие концы могут реассоциировать, т.е. слипаться за счет комплементарных взаимодействий.

Для поддержания высокой специфичности in vitro необходимо создавать оптимальные условия в реакционной смеси. При нарушении этих условий у некоторых рестриктаз проявляется вторичная (т.н. штриховая) активность. Так рестриктаза EcoRI расщепляет последовательность GAATTC при рН 7.3, 100 мМ NaCl в присутствии 5мМ MgCl₂. При снижении рН, понижении концентрации NaCl и замене ионов магния на ионы марганца, а также в присутствии органических растворителей фермент может расщеплять более короткую последовательность AATT.

В клетках прокариот присутствует спермидин – полиамин, значительно повышающий точность гидролиза ДНК.

Прототипы – рестриктазы, узнающие ранее неизвестные последовательности.

Изошизомеры – ферменты, выделенные из различных микроорганизмов, узнающие одну и ту же последовательность и образующие одинаковый спектр фрагментов ДНК (истинные). Если при этом образуются разные фрагменты, изошизомеры называют ложными.

Внутри этого класса выявлены ферменты, которые in vivo расщепляют только метилированные двухцепочечные молекулы ДНК, а также ферменты, узнающие непалиндромные структуры и расщепляющие ДНК на строго фиксированном расстоянии от участка узнавания с образованием как тупых, так и липких концов.

ЗАДАЧА:

Пространственная разобщенность участков узнавания и расщепления ДНК для некоторых рестриктаз позволила разработать методику расщепления одноцепочечной ДНК в любом выбранном участке:

Синтезируем олигонуклеотид, на одном конце которого находится взаимокомплементарная последовательность, способная образовывать двухцепочечную шпильку. В шпильке располагается участок узнавания рестриктазы. Второй конец олигонуклеотида комплементарен выбранному району одноцепочечной ДНК и может образовывать с ней комплекс.

Обработка комплекса соответствующей рестриктазой позволяет произвести разрез в выбранной точке одноцепочечной ДНК.