Ферменты

Ф – это биологические катализаторы белковой природы, которые, катализируя отдельные реакции, обеспечивают протекание обмена веществ в живых организмах. В отличие от неорганических катализаторов, Ф: 1. обладают на несколько порядков более высокой каталитической активностью, т.е. скорость ферментативного катализа на несколько порядков выше (10⁸ – 10¹⁴), чем небиологического катализа, вследствие снижения ферментом энергии активации (Еакт.), 2. Ф функционируют в мягких условиях – при физиологических значениях рН, t⁰, р, 3. Ф обладают высокой специфичностью действия (субстратной, каталитической), 4. для Ф характерен широкий спектр действия, т.е. Ф катализируют реакции самых разнообразных типов, 5. для Ф характерна кооперативность и последовательность действия, 6. активность Ф и их количество регулируется в живых системах. При этом Ф, как и неорганические катализаторы: 1. катализируют только энергетически возможные реакции, 2. не изменяют направление реакции и не изменяют равновесия обратимой реакции, а только ускоряют его наступление, 3. не расходуются в процессе реакции.

Значительная часть Ф является сложными белками – холоферментами, которые состоят из апофермента и небелкового компонента – кофактора, который может быть представлен коферментом и ионом металла (железо, медь, магний, цинк, кальций и др. – 1. являются электрофильной группой активного центра фермента, способной взаимодействовать с отрицательно заряженными группами субстрата; 2. могут служить мостиком между апоферментом и коферментом; 3. металл с переменной валентностью может участвовать в переносе электронов). Коферменты делятся на 2 группы: 1. производные витаминов – ТПФ (В₁-тиамин), ФАД и ФМН (В₂-рибофлавин), КоАSН (В₅-пантотеновая кислота), НАД⁺ и НАДФ⁺ (РР-никотинамид), Пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат (В₆-пиридоксин), ТГФК (В₉-фолиевая кислота), Аскорбиновая кислота – вит.С, Карбоксибиоцитин (Н-биотин), Метилкобаламин и 5-дезоксиаденозилкобаламин (В₁₂-кобаламин); 2. невитаминные коферменты – S-Аденозилметионин (SАМ), фосфоаденозинфосфат (ФАФ), АДФ, УДФ, ЦДФ, гем, глутатион, убихинон, α-кетоглутарат и др.

Активный центр Ф (АЦ) - участок молекулы Ф, к которому присоединяется субстрат (S) и который обеспечивает его превращение в продукт (Р) реакции. АЦ представляет собой уникальную пространственную конфигурацию из функциональных групп аминокислот; форма и размеры АЦ соответствуют пространственной структуре S. В формировании АЦ участвуют функциональные группы а/к: карбоксильные -СООН группы глу и асп; ОН-группы тре, тир, сер; NН₂-группы арг, лиз; SН-гр. цистеина; гидрофобные радикалы а/к и др. В АЦ выделяют якорный участок, ответственный за присоединение S, и каталитический, ответственный за превращение S в Р реакции.

Этапы ферментативного катализа и механизм действия Ф: 1. диффузия S к Ф, их оптимальное сближение и специфическое связывание функциональных групп а/к активного центра Ф с S, с обазованием фермент-субстратного комплекса (ЕS). 2. преобразование S за счет 2-х механизмов: а). кислотно-основного катализа (обмен протонами между S и активным центром Ф) и б). ковалентного (нуклеофильно-электрофильного) катализа (происходит обмен электронами между S и активным центром Ф), в результате происходят электронно-конформационные перестройки с переходом одного неустойчивого переходного ЕS комплекса к другому ЕS *. 3. S в ЕS комплксе становится энергетически неустойчивым, происходит расшатывание его структуры, возникает эффект «дыбы» - натяжение межатомарных связей, структура S дестабилизируется, происходит изменение его электронной структуры, и формируется продукт, который отделяется от активного центра Ф: Е + S → Е S → Е S * → Е Р → Е + Р. При взаимодействии Е с S происходит многоточечное связывание S с функциональными группами а/к, коферментом, ионами металлов активного центра Ф → образуется целая сеть связей: водородных, электростатических, гидрофобных – эти связи являются подвижными, что обеспечивает электронно-конформационные перестройки при переходе одного нестабильного промежуточного активированного состояния в другое (ЕS → ЕS *). Суть действия Ф: очень медленно протекающая, благодаря высокому энергетическому барьеру (Ебар.), реакция с участием фермента начинает протекать по-иному: вместо одной прямой реакции с высоким энергетическим барьером, в ЕS комплексе начинает протекать несколько новых реакций, каждая из которых имеет более низкий энергетический барьер (низкую энергию активации – Еакт.) и запаса энергии у реагирующих молекул хватает для превращения S в продукт реакции- Р. При этом сумма Еакт. промежуточных реакций меньше Еакт. некатализируемой реакции. Энергетический барьер (Ебар.) реакции – минимальный запас энергии у молекул системы, который обеспечивает протекание реакции. Энергия активации (Еакт.) – энергия, которую необходимо дополнительно сообщить молекулам системы, чтобы достичь уровня Ебар. и преодолеть его, чтобы реакция началась. Ф снижают Еакт. путем увеличения числа активированных молекул, которые становятся реакционно способными на более низком энергетическом уровне.

Теорию механизма действия и кинетику ферментативного катализа разработали Михаэлис и Ментен в 1913г. Скорость (υ) ферментативной реакции является мерой каталитической активности фермента. Графически зависимость υ от концентрации S описывается гиперболой и называется кривой Михаэлиса. Константа Михаэлиса – Кm характеризует каталитическую активность Ф, чем меньше Кm, тем выше активность фермента. Кm отражает сродство Ф к S: чем меньше Кm, тем выше сродство. Кm соответствует той концентрации S, при которой скорость реакции достигает ½ Vmax (Vmax достигается при насыщении всех молекул фермента S). Линейное преобразование по методу двойных обратных величин (1/Vmax и 1/Кm) по Лайнуиверу-Берку используется для практического определения ключевых показателей каталитической активности - Vmax и Кm. Математически выражение зависимости υ от концентрации S описывается уравнением Михаэлиса-Ментен: υ = Vmax ^. [S] / Кm + [S].

Активность Ф определяется по снижению количества S или по нарастанию количества Р реакции. Скорость реакции определяют как изменение [ S ] или [ Р ] в единицу времени (моль/л ^. сек). 1 катал – количество Ф, которое превращает 1 моль S за 1 секунду. Международные единицы активности (МЕ) – кол-во Ф, превращающего 1 мкмоль S за 1 минуту. Удельная активность – количество каталов / масса белка (г).

Зависимость υ от t: с увеличением температуры на каждые 10⁰ скорость реакции возрастает в 2 раза. Оптимальная t для большинства Ф составляет 40-50⁰, скорость реакции↓ вследствие тепловой денатурации. Зависимость υ от рН: активность Ф ↓при отклонении рН среды от оптимальных значений в обе стороны, т.к. рН влияет на ионизацию функциональных групп в активном центре Ф (исключение – для пепсина опт. рН= 1,5-2,5; для аргиназы – 9,5-9,9).

Специфичность действия Ф - характеризует способность Ф катализировать только одну определенную реакцию, воздействуя лишь на один S или группу структурно сходных S. В основе специфичности лежит высокое соответствие, т.е. пространственная и электровалентная комплементарность S и АЦ фермента. Выделяют: 1. абсолютную субстратную специфичность – характеризует способность Ф катализировать превращение только 1-ого S (пример – аргиназа, расщепляющая аргинин на мочевину и орнитин), 2. относительную – способность Ф превращать группу структурно сходных субстратов (по функциональной группе, по химической связи), напр., гексокиназа – катализирует фосфорилирование глюкозы, фруктозы, галактозы), 3. стереоспецифичность - Ф катализирует превращение только одного из 2-х стереоизомеров (напр., лактатдегидрогеназа превращает только L-лактат, но не D; оксидаза аминокислот окисляет только L-аминокислоты, но не D).

Классификация и номенклатура Ф: в основе лежит тип катализируемой реакции, в каждом из 6 классов объединены Ф, обладающие одинаковой реакционной специфичностью. Подклассы и подподклассы сформированы с учетом преобразуемой группы субстрата. Каждый Ф имеет свой 4^х-значный классификационный номер. Названия Ф составляются из названия S, типа катализируемой реакции (концевой суффикс – аза). 1класс: оксидоредуктазы – катализируют ОВР, окисляя субстраты (S) путем дегидрирования с переносом 2-х электронов (2е^-) и 2Н⁺ (протонов) на кислород (называются аэробными дегидрогеназами) и на другой субстрат (анаэробные дегидрогеназы), и путем присоединения 1 или 2-х атомов кислорода, при участии моно- или диокигеназ, соответственно. Все Ф этого класса – сложные белки, коферментами которых могут быть – НАД⁺, НАДФ⁺, ФАД, ФМН, гем. Важнейшие подклассы: дегидрогеназы аэробные и анаэробные, редуктазы, моно- и диоксигеназы. Представители: лактатдегидрогеназа (ЛДГ), сукцинатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, фенилаланинмонооксигеназа. 2 класс: трансферазы – катализируют перенос атомных групп, радикалов с S на S. Коферменты – КоАSН, ТГФК, АДФ, УДФ, ЦДФ, ФАФ, Пиридоксальфосфат, Метил-кобаламин, Биоцитин, SАМ. Подклассы: Аминотрансферазы, сульфотрансферазы, ацилтрансферазы и др. 3 класс: гидролазы – катализируют разрыв связи с присоединением воды. Деполимеризуют сложные S до низкомолекулярных веществ. Особенно важна их роль в переваривании в ЖКТ. Большинство Ф этого класса – простые белки. Подклассы: эстеразы, пептидазы, амилаза, АТФаза и др. 4 класс: лиазы – катализируют негидролитический и неокислительный распад веществ по –С - С-, -С - О-, -С - N- связям, с замыканием двойных связей и выделением простых веществ: СО₂, NН₃, Н₂О, а также - обратные этим реакции и тогда называются синтазами. Коферменты: ТДФ, пиридоксальфосфат. Представители: пируватдекарбоксилаза, цитратсинтаза и др. 5 класс: изомеразы – катализируют внутримолекулярные превращения – перенос водородов, групп атомов, перемещение двойных связей и др. Коферменты: НАД⁺, пиридоксальфосфат, 5-Дезоксиаденозилкобаламин. Представители: глюкозо-Ф)-изомераза, триозо-Ф)-изомераза и др. 6 класс: лигазы (синтетазы) – катализируют реакции синтеза субстратов с затратами энергии АТФ. Большинство – простые белки, некоторые содержат биотин. Представители: пируваткарбоксилаза, глутамин- и аспарагинсинтетазы.

Изоферменты (ИФ) – генетически детерминированные молекулярные формы ферментов, которые катализируют одну и туже реакцию, но различаются по каталитической активности, т.е. по Кm и Vmax, что связано с различиями в структуре, ф/х свойствах, чувствительности к аллостерическим модуляторам и др. ИФ одного семейства неравномерно распределены в разных органах и тканях, в субклеточных структурах, что обусловливает разную интенсивность протекания соответствующих реакций, т.е ИФ выполняют регуляторную роль в метаболизме. Являясь органоспецифичными, ИФ играют большую роль в энзимодиагностике, т.к. в норме в крови они не выявляются (в следовых количествах), а обнаруживают пик активности в крови только при деструктивных процессах в тканях. Например, 1). Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – состоит из 4 -х субъединиц 2 -х типов: М и Н, разное сочетание которых порождает 5 изоформ: ЛДГ1 (4Н) и ЛДГ2 (3Н1М) – в сердце, э/ц, л/ц, почках; ЛДГ3 (2Н2М) – в поджелудочной железе, т/ц, л/ц; ЛДГ4 (1Н3М) и ЛДГ5 (4М) – в печени, скелетной мускулатуре. ЛДГ – катализирует обратимую реакцию НАДНН⁺/НАД⁺ -завимого превращения пирувата в лактат. Активность ЛДГ1,2 повышается в крови при инфаркте миокарда, ЛДГ4,5 – при патологиях печени и скелетной мускулатуры. 2). Креатинкиназа (КК) – сотоит из 2-х субъединиц (М и В), разное сочетание которых образует 3- и изофермента: ММ – преимущественно локализован в скелетной мускулатуре (активность↑в крови при заболеваниях скелетной мускулатуры – миозиты, миопатии), МВ – в сердце (↑в крови при инфаркте миокарда, сердечной недостаточности), ВВ – в мозге (↑при нарушении мозгового кровообращения). КК – катализирует реакцию АТФ -зависимого фосфорилирования креатина в креатин-Ф). 3). Липаза – является абсолютно органоспецифичным ферментом для поджелудочной железы и уровень липазы ↑в крови при панкреатите.

Ферменты крови делятся на: 1. индикаторные (внутриклеточные), 2. секреторные (синтезируются в печени и секретируются в кровь для выполнения определенных функций, например, ферменты системы свертывания крови), 3. экскреторные (синтезируются в печени и вырабатываются в норме в составе желчи, а при патологии выходят в кровь, как например, щелочная фосфатаза).

Аллостерические ферменты (АФ) – это регуляторные Ф, которыев своей молекуле, помимо активного центра, имеют регуляторный – аллостерический центр, с которым взаимодействуют эффекторы (модуляторы), изменяющие каталитическую активность Ф вследствие его конформационных перестроек. При этом активность Ф ↑или↓. АФ, как правило, располагаются вначале метаболического пути и изменение их активности под действием эффекторов сопровождается либо↑ интенсивности всего процесса, либо↓. Роль эффекторов могут выполнять различные метаболиты, коферменты, ионы металлов, гормоны, продукты, иногда субстраты. АФ делятся на: 1. гетеротропные - эффектором для них является определенный метаболит, но не субстрат; 2. гомотропные – сами субстраты являются их положительными эффекторами, ↑их активность. Пример АФ – фосфофруктокиназа (ФФК), которая катализирует одну из реакций гликолиза - реакцию фосфорилирования фруктозо-6Ф) во фруктозо 1,6-диФ). АДФ и остаток фосфорной кислоты являются положительными эффекторами ФФК, а АТФ – отрицательным эффектором.

Ингибирование ферментов – происходит при действии веществ, угнетающих каталитическую активность Ф. Виды ингибирования: 1. необратимое – стойкое ингибирование Ф, вызванное ковалентным связыванием ингибитора (I) с Ф (с его активным центром или вне АЦ), что сопровождается значительной модификацией Ф (разрушение или изменение 1 или нескольких функциональных групп Ф). Пример - действие ионов тяжелых металлов: мышьяка, ртути, которые ингибируют ферменты ПДГ-комплекса; свинца и ртути, которые ингибируют ферменты синтеза гема. 2. обратимое – I действует обратимо, образуя нековалентные связи с Ф, и при определенных условиях диссоциирует с восстановлением активности Ф. Обратимое ингибирование делится на: а). конкурентное – вызывается действием веществ, являющихся структурными аналогами S. I соединяется с АЦ фермента, подменяя собой S. Но повышением концентрации S можно вытеснить I из АЦ фермента и снять торможение реакции. При конкурентном ингибировании↑ Кm, но Vmax – не меняется. Пример, сукцинатдегидрогеназа (катализирует превращение сукцината в фумарат в цикле Кребса) тормозится малоновой кислотой, которая является структурным аналогом сукцината. б). неконкурентное ингибирование – I не имеет структурного сходства с S и присоединяется к Ф одновременно с S, при этом образуется тройной Ф - S - I комплекс. Присоединяется I в области АЦ фермента, или вне его, изменяет конформацию Ф (особенно его АЦ), что сопровождается потерей ферментативной активности. Повышением концентрации S, вернуть активность Ф не удается. Реактивации Ф можно достичь только действием связывающих I веществ. При неконкурентном ингибировании↓ Vmax при неизмененной Кm. в). субстратное ингибирование – возникает при избытке S. К Ф, в этом случае, может присоединяться добавочная молекула S, вследствие чего образуется непродуктивный Ф - S комплекс. г). аллостерическое ингибирование – происходит при присоединении к аллостерическому центру Ф отрицательного эффектора, что ведет к конформационным перестройкам в молекуле Ф и↓ его активности.

Энзимопатология – заболевания, связанные с нарушением функционирования Ф. Типы энзимопатий: 1. наследственные – обусловлены врожденной недстаточностью активности Ф вследствие изменения его структуры или нарушения синтеза Ф. Примеры, 1). Фенилкетонурия – развивается при↓активности фенилаланинмонооксигеназы, катализирующей гидроксилирование ф/а в тир, 2). Галактоземия – при↓ активности галактозо-1Ф)-уридилил-трансферазы, 3). Гликогенозы (например, болезнь Гирке – ↓активности глюкозо-6Ф)-фосфатазы, агликогеноз (↓ гликогенсинтазы), 4). Мукополисахаридозы (↓ активности ферментов распада гликозаминогликанов), 5). Порфирии (↓ активности ферментов синтеза гема) и др. 2. алиментарные (пищевые) – возникают при недостатке поступления в организм витаминов, микроэлементов, н/з а/к. 3. токсические – развиваются при действии на организм токсинов инфекционных агентов, при передозировке лекарственных препаратов, которые могут быть конкурентными или неконкурентными I ферментов. 4. энзимопатии, связанные с нарушением организации метаболических процессов, например, при нарушении кровоснабжения тканей.

Энзимодиагностика – определение активности Ф в биологических объектах (крови, моче, желудочном соке, ликворе, биоптатах) с целью постановки диагноза, а также использование Ф в качестве реактивов при проведении различных биохимических анализов. Энзимодиагностика основана на неравномерном, иногда специфическом, распределении Ф (изо Ф) в разных органах и тканях. В кровь Ф поступает из клеток при формировании патологического очага. При патологии в сыворотке крови могут наблюдаться следующие изменения в содержании Ф: 1. гиперферментемия, 2. гипоферментемия, 3. появление в крови Ф, в норме отсутствующего.

Энзимотерапия – использование в лечебных целях Ф и лекарственных веществ, влияющих на их активность. В лечебных целях применяют Ф, ко Ф (витамины, микроэлементы), активаторы (напр., гормоны) и нгибиторы Ф (лекарственные в-ва, конкурентно ингибирущие Ф (например, сульфаниламиды); неконкурентно ингибирующие (аспирин – ↓ активность циклоксигеназы → ↓синтез простагландинов, ↓тромбоксанов); антибиотики – ингибирующие синтез Ф.

Регуляция активности Ф: выделяют 2 механизма регуляции: 1). быстрая – осуществляется за счет изменения активности Ф вследствие изменения свойств окружающей среды: рН, t, концентрации S, ко Ф, Р, присоединение I, активатора, или вследствие изменения активности регуляторных (аллостерических) ферментов. 2). более медленная регуляция – путем изменения концентрации Ф, за счет регуляции скорости их синтеза или за счет изменения интенсивности их деградации. Ф делятся на конститутивные – концентрация их к клетке постоянна, следовательно скорость их синтеза не регулируется, и на регулируемые, которые в свою очередь подразделяются на адаптивные (индуцибельные) – их синтез при необходимости стимулируется соответствующим индуктором (ферменты катаболизма активируются ↑-ем концентрации S, и репрессируемые – их синтез подавляется при увеличении в клетке корепрессоров, (напр.,↑концентрации продукта активирует ферменты анаболизма).

Механизмы активирования Ф: 1. активирование про Ф путем частичного протеолиза (напр., пепсиноген → в пепсин под действием соляной кислоты в желудке), 2. активирование ионами металлов, участвующих в формировании АЦ фермента или в связывании S (напр., Nа⁺,К⁺-АТФ(аза) – активируется ионами Nа⁺, К⁺), 3. активирование восстановителями (напр., глутатион, аскорбиновая кислота, которые предохраняют от окисления SН –группы Ф, важные для каталитической функции). 4. за счет ковалентной модификации Ф путем фосфорилирования/дефосфорилирования (напр., гликогенфосфорилаза «в» переходит в активную форму «а» за счет фосфорилирования). 5. аллостерическая активация под действием аллостерических эффекторов. 6. за счет диссоциации неактивного комплекса фермент-белок или диссоциации субъединиц молекулы Ф (активация протеинкиназы при диссоциации на каталитические и регуляторные субъдиницы под действием вторичного посредника – цАМФ), или наоборот, ассоцация субъединиц Ф.