Пропитывание промежуточной жидкостью и парафином

Для получения тонких микротомных срезов толщиной в не­сколько микрометров материал необходимо залить в парафин, который представляет собой смесь углеводородов (реже исполь­зуют целлоидин или желатин). Температура плавления его мо­жет быть различной. Для цитоэмбриологических исследований лучше брать парафин с температурой плавления 52-54 °С. Он не смешивается со спиртом и водой, но хорошо растворяется и хлороформе, ксилоле, бензоле, толуоле. Промышленность выпу­скает гомогенизированный парафин в виде полупрозрачных бе­лых плиток без примесей и пузырьков воздуха. Имея набор па­рафинов с различной температурой плавления, можно составить из них нужное вещество.

Гомогенизированный парафин перед употреблением расплав­ляют и выдерживают в таком состоянии в термостате один или несколько дней для того, чтобы улетучились нежелательные при­меси. К тугоплавкому парафину прибавляют 5% пчелиного воска. Для хрупких объектов к парафину с температурой плав­ления 54-60 °С, кроме воска, добавляют 5% стеарина. От меха­нических примесей парафин освобождают фильтрованием в тер­мостате на обычном фильтре. Так можно очищать все обрезки парафина, образовавшиеся во время работы.

Температуру плавления парафина легко определить следую­щим образом. Берут стеклянный капилляр, термометр и стакан с водой. Капилляр заполняют расплавленным парафином и пос­ле застывания парафина привязывают к термометру, помещают в стакан с водой, которую при этом медленно подогревают. От­мечают температуру в тот момент, когда парафин расплавится.

Успешно заключить объект в парафин удается только в том случае, если было проведено тщательное обезвоживание фик­сированного материала в 96%-м растворе и 100%-м этиловом спирте. Однако и в этом случае его не сразу помещают в пара­фин, поскольку спирт с парафином не смешивается. Обычно пос­ле абсолютного спирта материал переносят в так называемую промежуточную жидкость - растворитель парафина, который позднее заменяют чистым парафином (табл. 1).

1. Растворители парафина и их основные свойства

Важнейшие требования к растворителю; он должен хорошо смешиваться со спиртом и растворять парафин при температуре его плавления, легко испаряться при той же температуре.

Хороший растворитель парафина для мелких объектов (кор­ни и бутоны) - хлороформ, а для крупных - бензол и ксилол. Это обусловлено тем, что последние два растворителя не так быстро испаряются, как хлороформ, поэтому пропитывание ма­териала парафином идет успешнее. Хлороформ, используемый как растворитель парафина, не должен содержать воды. Для этого его наливают в темную бутыль, на дно которой насыпают безводный хлорид кальция слоем 3-4 см и выдерживают неко­торое время.

Обезвоженный в спирте материал пропитывают растворите­лем парафина не сразу, а постепенно. Обычно готовят три сме­си хлороформа с абсолютным спиртом с постепенно возрастаю­щей концентрацией хлороформа:

1 ч. хлороформа 4- 3 ч. абсолютного спирта;

1 ч. хлороформа 4- I ч. абсолютного спирта;

3 ч. хлороформа + 1 ч. абсолютного спирта.

В каждой из этих смесей материал выдерживают около часа. Для более крупных объектов время увеличивают. В дальней­шем материал переносят в первую, а затем во вторую склянку с чистым хлороформом, каждый раз оставляя в нем на час или более. После этого чистый хлороформ в объекте замещают на парафин следующим образом. Корни или бутоны вместе с эти­кеткой переносят в небольшие стеклянные стаканчики диамет­ром 2,5 см и высотой 3 см с хлороформом, уровень которого на 3-4 мм выше материала. В эти стаканчики наливают расплав­ленный парафин и ставят их в термостат с постоянной темпера­турой 56-57 °С, т. е. на 2-3°С выше температуры плавления парафина. Здесь материал, выдерживают несколько суток. За это время хлороформ испаряется, а объект пропитывается па­рафином. Окончательное испарение хлороформа устанавливают по отсутствию запаха у парафина в стаканчиках (проверяют каждый стаканчик).

Термостат, в котором находится материал, должен иметь надежный терморегулятор, чтобы поддерживать постоянную температуру, не допуская больших скачков, отверстия для при­тока воздуха и оттока паров хлороформа и достаточно толстые стенки. Он не должен искрить. Промышленность выпускает для заливки парафина термостат ТВЗ-25. Электрические контакты терморегулятора не должны находиться на пути оттока паров бензола или ксилола, в противном случае возможем взрыв. Тер­мостат необходимо поместить в вытяжной шкаф, так как пары хлороформа вредны для здоровья. При отсутствии вытяжного шкафа вентиляционное отверстие термостата соединяют с водо­струйным насосом, выводной конец которого не должен выхо­дить за пределы лаборатории.

Когда материал пропитается парафином, в стаканчики до­бавляют еще немного чистого расплавленного парафина и спу­стя некоторое время выливают содержимое в подготовленные бумажные коробочки (рис. 27), металлические или фарфоровые формочки, в которых парафин быстро застывает. При этом со­блюдают такую последовательность работы.

1. Заранее готовят бумажные коробочки из пергамента или другой плотной бумаги.

2. Вынимают пинцетом этикетки из стаканчика, а содержимое выливают в коробочку.

3. Корни или бутоны быстро и равномерно раскладывают по дну коробочки нагретым пинцетом.

4. На поверхность слегка застывшего парафина осторожно кладут этикетку надписью вверх.

5. Коробочки помещают на поверхность холодной воды в широкую чашку. Охлаждение парафина необходимо для того, чтобы он меньше крошился во время резки на микротоме.

Рис. 27. Изготовление бумажных коробочек. Цифры указывают последовательность сгибания бумаги. По Д. Кисели.

Парафин вместе с объектами после охлаждения принимает форму коробочки, в которую его залили («парафиновый пря­ник»). Если сиять бумажную коробочку, то сквозь полупрозрач­ный парафин хорошо видны корни/или бутоны. В та­ком состоянии материал может долго храниться и легко выплав­ляется при изготовлении блоков.