Листерио3

Возбудитель - Listeria monocytogenes - полиморфная, чаще палочковидная бактерия, подвижная, особенно выращенная при 22⁰С в молодых культурах грамположительна. Восстанавливает индикаторные краски. По соматическим ан­тигенам разделяется на четыре основных серотипа.

Материал для исследования: труп животного или голова, головной мозг, паренхиматозные органы, абортированныи плод и его оболочки, молоко из пора­женных долеи (при мастите), истечения из половых органов.

Исследование проводят микроскопическим, бактериологичеоким, серологиче­ским и биологическим методами.

Посевы. Из паренхиматозных органов и обязательно из разных участков го­ловного мозга делают обильные высевы из каждого объекта в 4-5 пробирок с МППБ, МППА или в мартеновский бульон и агар. В среды добавляют 1 % глю­козы и 2-3% глицерина. При исследовании абортированных плодов посевы делают из внутренних органов и содержимого желудка. Если подозревают за­грязнение материала посторонней микрофлорой, высевают на среды с теллуритом калия или с полимиксином. Истечения из половых органов и молоко сеют на МППА с глюкозой и глицерином в чашки и в МППБ с 10% хлорида натрия. Инкубация при 37⁰С. При отсутствии роста за посевами наблюдают до двух недель.

Микроскопия. Мазки из органов и других материалов делают в двух сериях: одну фиксируют над пламенем, а другую - этиловым спиртом. Мазки из голов­ного мозга и молока после фиксирования обезжиривают в двух сменах ацетона по 5 мин. Первую серию мазков окрашивают по Граму для световой микроско­пии, а вторую поливалентной листериозной флуоресцирующей сывороткой.

Бактериологическое исследование. Полученные на 2-3-й день культуры пере­севают и проверяют: на окрашиваемость по Граму и листериозной флуоресцирующей сывороткой на подвижность в «раздавленной капле», приготовленной из 6-12-часовой бульонной культуры, или высевом в полужидкий агар (см. Выделение и изуче­ние чистых микробных культур). Оба посева выращивают при комнатной тем ­ пературе (22⁰С);

на ферментативную активность - высевами в среды с глюкозой мальтозой рамнозой, салицином, трегаловой, дульцитом, инулином, раффинозой;

на каталазу - к суточнои культуре в МПБ добавляют равный объем све­жеприготовленного 5%-ного раствора перекиси водорода или к суточной куль­туре на МПА в пробирку добавляют несколько капель перекиси водорода. Пено­образование характерно для листерий;

на редуцирующую сособность - высевами в жидкие среды с лакмусом, метиленовои синью и неитральротом, конгоротом, метилротом и амидочерным. Контроли: инкубация тех же сред незасеянных;

в реакции фаголизиса с листериозными монофагами L2A я L4A.

Постановка реакции фаголилиса. Сухой фаг в ампуле растворяют бульоном Мартена или МПБ в объеме, указанном на этикетке и асенти­чески пере носят в пробирку. Прозрачный асептический раствор фага пригоден к употреблению в течение 10 суток (хранить при 2-6⁰С). При наличии осадка, хлопьев или помутнения фаг негоден. Ампулы, пробирки и пипетки из-под фага бракованный или неиспользованный фаг кипятят в течение 30 мин.

Исследование проводят в чашках с 20%-ным агаром Мартена или МПА с 0,5% глюкозы. Среду разливают накануне и подсушивают.

Культуру берут 16-18-часовую с агара и вносят петлей в бульон Мартена или в МПБ с 0,5% глюкозы столько, чтобы среда слегка опалесцировала Посев инкубируют 4 ч при 37⁰С. Затем 0,2 мл (4-5 капель) культуры наносят в чашку с ага ром и рассевают шпателем по всей среде. В одной чашке можно испытывать две культуры, для чето площадь среды делят пополам и на каждую половину высевают отдельным шпателем по 2-3 капли культуры. Каждую культуру испытывают параллельно с обоими фагамн. Посевы инкубируют при 37⁰С в течение 1-1/2 ч, слегка приоткрыв чашки, а затем на засеянную пло­щадь в заранее намеченных трех точках наносят по капле фагов и каплю стерильного МПБ (контроль). Расстояние между каплями должно быть не менее­ 2 см. После впитывания капель в среду посевы инкубируют при 28⁰С в термо­стате или при 22⁰С в затемненном месте. Учет реакции через 16-24 ч.

Смешанные культуры перед проверкой очищают: делают отвивки наиболее характерных колоний или дробно высевают на чашки с плотной средой с целью получения изолированных колоний возбудителя культуру можно также очистить биологически, путем заражения молодых белых мышей массой до 16 г, с последующим высевом 'из органов павших мышей.

Серологические исследования. Для видовой идентификации листерий в пластинчатой реакции агглютинации применяют поливалентную листериозную сыво­ротку, содержащую антитела к соматическим О-антигенам II, V, VI, VII, IX и к жгутиковым Н-антигенам АВ. Эта сыворотка открывает все известные серотипы листерий. Серогруппы листерий определяют с помощью двух О-сывороток: и антигену II и к антигенам V, VI.

Антиген для реакции агглютинации: выращенную при 18-26⁰С без доступа света суточную бульонную культуру засевают в 2-3 пробирки на косой агар и инкубируют при тех же условиях. Через 24 ч физиологическим раствором де­лают густой смыв и доводят его до концентрации 100-1050 единиц мутности по оптическому стандарту.

На предметное стекло наносят каплю поливалентной сыворотки и каплю физиологического раствора (контроль). К ним добавляют по капле антиген и тщательно перемешивают.

Реакцию учитывают с появлением агглютинатов не позднее чем через 3 мин. При положительной реакции с поливалентной сывороткой и отрицатель­ном контроле исследуемую культуру признают листериозной и ставят реакцию с групповыми агглютинирующими сыворотками, что выполняется вышеописан­ным порядком.

В случаях, когда РА с обеими групповыми сыворотками отрицательна или сомнительна, серогруппу культуры определяют в «пробе роста» со специальны­ми сыворотками той же специфичности. Для этого в две пробирки с 4-5 мл МПБ (МППБ) асептически добавляют по 0,05-0,06 мл той или иной сыворотки роста; предварительно их проверяют на стерильнОсть, выдерживая при 37⁰С 24 ч. Затем делают высе·вы петлей из суточной бульонной культуры и инкубиру­ют пру 37⁰С 24-48 ч.

Учет результатов. В присутствии гомологичной сыворотки листерии этой группы образуют хлопья без помутнения бульона, а листерии другой груп­пы дают, равномерное помутнение среды. По этим признакам и определяют серо­группу возбудителя.

Смешанные культуры листерий двух серогрупп вызывают в обеих пробирках помутнение среды с образованием хлопьев. При необходимости выделения одно­типных листерий из верхнего слоя каждой пробирки одну каплю мутного бульона высевают дробно на 4-5 чашек с МППА. Через 24 ч инкубации проверяют не­сколько колоний в пластинчатой РА. Если культуру высевали из пробирки ссывороткой второй серогруппы, то РА ставят с сыроваткой первой серогруппы (к антигену II), и наоборот. При положительной РА из соответстующих коло­ипй отсевают чистую культуру.

Биологическое исследование проводят путем заражения лабораторных жи­вотных и постановки конъюнктивальной и внутрикожной пробы.

Суспензией из головного мозга и внутренних органов 1:5 в физиологиче­ском растворе, приготовленной сразу же после посевов, или двухсуточной буль­онной культурой заражают 2-3 белых мышей массой 18 г подкожно или внутри­брюшинно в дозе 0,3-0,5 мл. Для уокорения патологического процесса мышам за 3-4 ч до заражения вводят внутримышечно кортизон в дозе 5 мг. Животные погибают через 2-6 суток. При вскрытии обычно отмечают некротические очаж­ки в паренхиматозных органах. Из органов делают высевы и мазки, которые окрашивают по Граму и флуоресцирующей листериозной сывороткой. За выжи­вающими животными наблюдают до 14 суток.

Конъюнктивальная проба. Бульонную культуру вносят в конъюнктивальный мешок морской свинке и делают легкий массаж ватным тампоном. Вирулентные листерии на 2-4-й день вызывают у свинки гнойный кератоконъюыктивит.

Внутрикожная проба. Шерсть на боку морской свинки или кролика тщатель­но выстригают и вводят в кожу 0,3-0,5 мл бульонной культуры. Через 24-48 ч развивается воспаление кожи с некрозом и образованием струпа.

Конъюнктивальную и внутрикожную пробы ставят одновременно на одной морской свинке.