Выделение чистых культур бактерий (ЧК)

I этап — получение изолированных колоний бактерий из исследуемого материала. При выделе­нии ЧК бактерий из испытуемого материала первоначально необходимо оценить концентрацию бактерий в материале. На I этапе выделения ЧК также осуществляют первоначальную идентификацию бактерий по морфологии и тинкториальным свойствам. Для решения этих задач из исследуемого материала

готовят фиксированный мазок, окрашивают по методу Грама (или другими методами в зависимости от цели исследования) и микроскопируют. Если количество бактерий в поле зрения велико, исследуемый материал разводят в пробирке со стериль­ным изотоническим раствором хлорида натрия. При малом количестве бактерий в препарате весь объем образца засевают на жидкие среды обогащения с целью увеличения концентра­ции бактерий. При необходимости выделения определенного вида бактерий посев осуществляют на элективные среды.

Для выделения ЧК бактерий из испытуемого материала необходимо сначала разобщить находящиеся в нем микробы разных видов. Обычно для этого посев материала производят на плотную питательную среду таким образом, чтобы получить изолированные колонии присутствующих в нем бактерий (см. выше). После посева чашку переворачивают дном кверху, под­писывают и помещают в термостат при 37 °С на 18—24 ч.

Иногда применяют метод пластинчатых разводок, который заключается в перемешивании различных разведений исследу­емого материала с расплавленным и остуженным питательным агаром в колбе или пробирке. После этого агар разливают в чашки Петри и инкубируют в термостате.

Разделение бактерий с использованием физических и химичес­ких факторов осуществляют следующим образом. Для выделе­ния спорообразующих бактерий уничтожают неспорообразую-щие, прогревая исследуемый материал при 80 "С в течение 20 мин или подвергают кратковременному кипячению. Споры бактерий при этом сохраняются и при посеве прогретого ма­териала на питательную среду прорастают. Если материал со­держал только один вид спорообразующих бактерий, таким образом можно получить ЧК. Если материал содержал споры разных бактерий, дальнейшее выделение осуществляют стан­дартными методами.

При выделении ЧК психрофильных бактерий используют инкубацию при низких температурах, задерживающих рост со­путствующей микрофлоры. Так, например, для выделения ЧК возбудителя чумы {Yersinia pestis) посевы инкубируют при тем­пературе около 5"С.

В ряде случаев ЧК бактерий можно получить путем подав­ления размножения части микробов в исследуемом материале воздействием на них факторами, к которым выделяемый вид устойчив. С этой целью используют антимикробные препара­ты, химические вещества и бактериофаги. В питательную среду вносят соответствующее вещество или фаг в строго определен­ной концентрации, препятствующей размножению сопутству­ющих бактерий, но не оказывающей выраженного ингибиру-ющего действия на исследуемый микроорганизм.

Кроме упомянутых, в бактериологической практике иногда применяют и другие методы. Например, для выделения чистой

культуры бактерий рода Proteus (Proteus vulgaris) используют его способность к "ползучему" росту (метод Шукевича). При этом бактерии, засеянные в основание скошенного агара, за время культивирования распространяются по всей поверхности агара.

II этап — накопление ЧК для ее дальнейшей идентификации. II этап начинают с оценки результатов первичного посева материала и изучения кулыпуралъных при­знаков выросших бактерий — особенностей их роста на пита­тельных средах.

Морфология микробных колоний является наиболее ин­формативным культуральным признаком. Колонии различают­ся по величине, форме, цвету, консистенции, контуру края, структуре и характеру поверхности (рис. 3.1.1). По величине колонии могут быть крупные (диаметр более 4—5 мм), средние (2—4 мм) и малые (1—2 мм), по форме — круглые, розеткооб-разные, листовидные и т.д. Цвет колонии зависит от выработки определенного пигмента — белого, желтого, красного и др. Ко­лонии непигментирующих бактерий бесцветны. По консистен­ции различаются сухие, влажные, сочные или слизистые коло­нии. Поверхность колонии бывает гладкой, морщинистой, ис­черченной, плоской, выпуклой, вдавленной. Край колонии может быть ровным, волнистым, бахромчатым. Колонии могут иметь аморфную, зернистую, волокнистую внутреннюю струк­туру.

При получении микробного газона характер роста бактерий может быть сухим, влажным, "ползучим", складчатым, пиг­ментированным. В жидкой питательной среде одни бактерии дают диффузное помутнение, другие характеризуются придон­ным или пристеночным ростом; некоторые культуры образуют пленки на поверхности среды, другие — осадок на дне пробир­ки, что преимущественно определяется потребностью в кисло­роде.

Для оценки результатов первичного посева исследуемого материала чашки с посевами просматривают и изучают мор­фологию выросших колоний. Для определения морфологии бактерий и их тинкториальных свойств из материала колоний разных типов готовят мазки, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Необходимо помнить, что родственные бак­терии могут отличаться по морфологии колоний и наоборот. Материал из изолированной колонии каждого типа пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии, и засевают штрихом на скошенную поверхность агара в пробирку. Для выделения и накопления чистой культуры выбирают колонии только тех бактерий, которые присутствовали в исследуемом материале. Появление колоний других бактерий может быть результатом контаминации (загрязнения) посева посторонними микробами

Рис.3.1.1. Типы бактериальных колоний, а — круглые с ровными краями; б — круглые, выпуклые, блестящие, слизистой консистенции; в — с неровными краями; г — круглые с валиком по периферии; Д — зернистые; е — плоские листовидные; ж — ветвистые; з — складчатые.

вследствие недостаточно строгого соблюдения стерильных ус­ловий работы.

Особенности культивирования анаэробных бактерий. Все ма­нипуляции со строгими анаэробами должны осуществляться в бескислородных условиях. Для этого используют герметичные настольные камеры с регулируемым газовым составом среды. Посевы производят на специальные обогатительные (электив­ные) среды для анаэробов (тиогликолевую, Китта—Тароцци). Посевы инкубируют в специальных С0₂-инкубаторах или в анаэростатах (металлических или пластмассовых контейнерах, герметично закрывающихся крышкой, снабженной патрубками для заполнения газовой смесью нужного состава), которые помещают в обычный термостат. Для инкубации небольших по объему посевов (1—2 чашки Петри) применяют пластиковые пакеты, содержащие химические генераторы газовой смеси, которые обеспечивают полное удаление кислорода из воздуш­ной среды в течение нескольких минут.