ДНК-вирусы

СЕМЕЙСТВО Adenoviridae

аденовирусы серотипов 1—39 ОРВИ, пневмония, отит, конъ-

юнктивит; гепатит и другие системные инфекции при им-мунодефицитах

СЕМЕЙСТВО Herpesviridae

ПОДСЕМЕЙСТВО Alphaherpesvirinae Фарингит, тонзиллит, трахео-

вирус простого герпеса 1-го типа бронхит; пневмония при имму-

(HSV-1) нодефицитах и др. (см. главу 21)

Тема 18.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

▲ План

А Программа

1. Биологические свойства возбудителей респираторных вирусных инфекций, их патогенность, экология, осо­бенность инфекций и эпидемиология вызываемых за­болеваний.

2. Микробиологическая диагностика.

3. Диагностические и лечебно-профилактические пре­параты.

▲ Демонстрация

1. Иммунофлюоресцентный метод экспресс-диагности­ки гриппа и ОРВИ.

2. Риноцитоскопия при гриппе и аденовирусной инфек­ции.

3. Диагностические и лечебно-профилактические пре­параты.

▲ Задание студентам

1. Ознакомиться с бланками-направлениями на исследо­вание в вирусологическую лабораторию.

2. Указать материал для исследования, необходимый для диагностики ОРВИ.

3. Оценить результаты реакции гемагглютинации с ма­териалом зараженного куриного эмбриона (амниоти-ческой и аллантоисной жидкостью), поставленной с целью индикации вируса гриппа.

4. Учесть результаты идентификации выделенного виру­са гриппа в РТГА. Сделать заключение.

5. Учесть результаты идентификации аденовирусов, вы­деленных в культуре клеток, в РСК.

6. Учесть результаты серодиагностики респираторных вирусных инфекций в РСК.

7. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профи­лактическими препаратами. Указать механизм их дей­ствия.

▲ Методические указания

• Микробиологическая диагностика гриппа и других респираторных вирусных инфекций

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: отделяемое из респи­раторного тракта, мазки и смывы со слизистой оболочки верх­них дыхательных путей, промывные воды бронхов, мокрота.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Цитологическое исследование. Мазки, приготовленные из исследуемого материала, окрашивают по методу Романовско­го—Гимзы или другими методами и микроскопируют. В поло­жительном случае наблюдаются признаки ЦПД вирусов. По­скольку большинство респираторных вирусов оказывают не­специфическое ЦПД (дегенерация и лизис зараженных кле­ток), метод является малоспецифичным и имеет ориентиро­вочное значение.

Цитологическое (риноцитоскопическое) исследование при­меняют как ориентировочный экспресс-метод лабораторной диагностики гриппа. С поверхности нижней носовой раковины

берут мазки-отпечатки. Препараты окрашивают смесью основ­ного фуксина и метиленового синего. В цитоплазме цилинд­рического эпителия, а также в цитоплазме дегенерированных макрофагов и лейкоцитов располагаются широко контуриро-ванные включения, окрашенные в красный цвет. Данный ме­тод позволяет дифференцировать грипп от аденовирусной ин­фекции, при которой наблюдаются деструкция клеток, вакуо­лизация ядер и образование внутриядерных включений.

Вирусологическое исследование. Исследуемый материал по­мещают в транспортную среду, содержащую антимикробные препараты широкого спектра действия для уничтожения сопут­ствующей бактериальной флоры. Затем материал центрифуги­руют. Для выделения чистой культуры производят заражение культур клеток надосадочной жидкостью. В зависимости от предполагаемого возбудителя используют разные типы клеточ­ных культур: клетки человека (первичные культуры эмбрио­нальных клеток, диплоидные линии фибробластов, перевивае­мые клеточные линии HeLa, НЕр-2 и др.) или животных (пер­вичные культуры клеток почки обезьян, линии мышиных фиб­робластов и др.). Культивирование респираторных вирусов мо­жет занимать от 2—3 до 20 сут и более в зависимости от природы возбудителя. Так, выделение аденовирусов занимает в среднем 6 сут, риновирусов — 4—5 сут, вируса гриппа — 3—4 сут, реовирусов — около 3 нед. Индикацию вирусов про­изводят по ЦПД. Для индикации гемагглютинирующих виру­сов (грипп, парагрипп) может быть использована реакция гем-адсорбции (см. тему 5.2), которая становится положительной еще до появления ЦПД. Идентификацию респираторных ви­русов осуществляют по их антигенной структуре с помощью иммунологических методов [иммунофлюоресценция, РТГА, РСК, реакция нейтрализации (РН), ИФА и др.]. Эти же реак­ции используют для типирования выделенных вирусов. При­меняют также биохимические (анализ фрагментов вирусных НК методом электрофореза) и молекулярно-биологические ме­тоды идентификации (ПЦР, метод нуклеиновых зондов).

Вирусологическое исследование не применяется для диа­гностики заболеваний, вызванных коронавирусами и РСВ, в связи со сложностью их культивирования.

В ряде случаев для выделения вируса гриппа используют куриные эмбрионы. Наличие вирусов гриппа в амниотической или аллантоисной жидкости устанавливают с помощью РГА (см. тему 5.2). Вирусы гриппа А хорошо агглютинируют эрит­роциты курицы, морской свинки, человека с группой крови 1(0), вирусы гриппа В — эритроциты курицы. Этот метод по­зволяет также установить титр вируса.

Идентификацию и типирование выделенной чистой культу­ры вируса гриппа осуществляют на основании антигенной структуры с помощью серологических реакций. Тип вируса

(А, В или С) определяют в РСК. Подтипы вируса гриппа А по Н- и N-антигенам (H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и др.) - в реакциях с набором типоспецифических сывороток к гемаг-глютинину и нейраминидазе (см. табл. 10.1.2 и 10.1.3). Иден­тификацию по Н-антигену проводят в РТГА, результаты реак­ции учитывают по отсутствию гемаготатинации. Для опреде­ления N-антигена применяют реакцию ингибиции нейрамини-дазы и реакцию иммунопреципитации в геле. Результаты РТГА (рис. 18.1.1; на вклейке), приведенные в табл. 10.1.3, свиде­тельствуют, что гемагглютинирующая активность исследуемого вируса нейтрализуется типоспецифической сывороткой N3H2 в разведениях 1:10—1:160 (до ее титра), т.е. исследуемый вирус относится к подтипу N3H2.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Метод ИФ является высо­коспецифичным, универсальным в отношении разных возбу­дителей методом экспресс-диагностики (схема 18.1.1). Он поз­воляет обнаружить антигены вируса-возбудителя заболевания непосредственно в инфицированных клетках, присутствующих в исследуемом материале. Используют прямой и непрямой методы ИФ (см. тему 10.1). Из исследуемого материала готовят мазки на нескольких предметных стеклах. Носоглоточные смы­вы предварительно центрифугируют и из осадка, содержащего зараженные клетки, готовят мазки. Препараты обрабатывают различными флюоресцирующими антителами (против вирусов гриппа А, В, против вирусов парагриппа II и III типов, против РСВ, поливалентной противоаденовирусной сывороткой и др.) и изучают методом люминесцентной микроскопии. В положи­тельном случае внутри клеток обнаруживают светящиеся ви­русные включения и обращают внимание на их внутриклеточ­ную локализацию. Так, при аденовирусной инфекции включе­ния располагаются преимущественно в ядре зараженных кле­ток, при гриппе и парагриппе — в цитоплазме.

Присутствие вирусных антигенов в исследуемом материале может быть выявлено с помощью чувствительных серологичес­ких реакций: ИФА, РИА и др.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ные НК в исследуемом материале обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Диагностика респираторных вирусных ин­фекций осуществляется методом парных сывороток. Кровь бе­рут на 1-й и 3-й неделе от начала заболевания. Диагностичес­кое значение имеет нарастание титра специфических противо­вирусных антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза. Серодиагностика при ОРВИ носит ретроспективный характер, поскольку накопление антител происходит в период реконва-лесценции — через 2—3 нед после начала заболевания. Метод

не позволяет своевременно установить диагноз, в связи с чем применяется преимущественно с целью ретроспективного под­тверждения диагноза и для эпидемиологического анализа.

Для обнаружения антител используют различные серологи­ческие реакции: РСК, РТГА, РН, непрямой ИФ, ИФА и др. В крови больных в ходе заболевания появляются антитела к различным антигенам возбудителя, для выявления которых применяют разные серологические реакции. Так, антитела к антигенам нуклеопротеида вируса парагриппа выявляют в РСК, а к антигенам суперкапсида — в РТГА. Вирус-нейтрали-зующие антитела обычно появляются в период реконвалесцен-ции и могут длительно сохраняться после перенесенного забо­левания. Для их обнаружения применяют РН.

Серодиагностика при риновирусных инфекциях не прово­дится в связи с большим числом серотипов (более 130) и отсутствием общих антигенов.

Серодиагностика гриппа. Наличие антител определя­ют с помощью РСК и РТГА со стандартными диагностикума-ми, представляющими собой наборы эталонных штаммов раз­личных серотипов вируса гриппа (табл. 18.1.1).

Таблица 18.1.1. Результаты РСК с парными сыворотками крови боль­ного (1 и 2) при серодиагностике гриппа и других ОРВИ

Диагностикум	Сыво­ротка №	Разведения сыворотки	Конт­роль сыво­ротки
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160

Вирус гриппа А (H3N2)		+ +
Вирус гриппа В	1 2	+ +
Аденовирус (поливалентный)	1 2	+ +
РСВ		+
		+

РСК более чувствительна, чем РТГА, и позволяет выявить антитела к любому штамму одного и того же серотипа вируса. Диагностическое значение имеет четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках (в период эпидемии грип­па) и двукратное нарастание в сыворотках крови больных при характерной клинической картине. Отсутствие нарастания тит­ра антител не исключает гриппозной инфекции.

• Микробиологическая диагностика респираторных инфекций, вызванных герпесвирусами (см. главу 21)

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Тест-системы для выявления антигенов респираторных ви­русов (гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиального) ме­тодом ИФ.

Типоспецифические гриппозные сыворотки H0N1, H1N1, H2N2, H3N3, В и С. Применяют для серотипирования вирусов гриппа в РТГА и РСК.

Типоспецифические парагргагаозные сыворотки. Используют для идентификации и серотипирования вирусов парагриппа.

Типоспецифические аденовирусные сыворотки. Применяют для серотипирования аденовирусов в реакции нейтрализации.

Сухие типоспецифические диагностикумы (гриппозный и парагриппозный). Используют для серодиагностики соответст­вующих инфекций.

Аденовирусные диагностикумы. Применяют для серодиагнос­тики аденовирусной инфекции.

Живая гриппозная вакцина. Готовят из аллантоисной жид­кости куриных эмбрионов, зараженных вакцинными штамма­ми вируса гриппа основных серотипов. Применяют для про­филактики гриппа (создание активного иммунитета). Вакцину вводят через нос или рот.

Убитая гриппозная вакцина. Инактивированные формалином цельные вирионы вакцинного штамма вируса гриппа, выра­щенного в культуре клеток. Вакцинный штамм получают еже­годно на основании данных эпидемиологического анализа с учетом предполагаемого направления антигенной изменчивос­ти вируса. Применяют для профилактики гриппа (создание активного иммунитета).

Расщепленные гриппозные вакцины. Получают путем инак­тивации цельных вирионов вируса гриппа вакцинного штам­ма (см. выше) с последующим разрушением и очисткой ком­понентов. Вакцина содержит основные протективные анти­гены вируса гриппа — гемагглютинин, нейраминидазу, а также ряд дополнительных белков (Ml, NP). Применяют для создания активного иммунитета с целью профилактики гриппа.

Субъединичные гриппозные вакцины. Содержит основные протективные антигены вируса гриппа (гемагглютинин и ней­раминидазу), полученные методом генной инженерии. Состав антигенов ежегодно обновляется с учетом предполагаемого на­правления антигенной изменчивости вируса.

Лечебно-профилактическая поливалентная гриппозная сыво­ротка. Получена путем гипериммунизации лошадей вирусами гриппа разных серотипов. Выпускают в сухом виде в смеси с антибиотиками и сульфаниламидами. Применяют интраназаль-но с целью экстренной профилактики гриппа и для лечения

больных в начале заболевания (создание пассивного иммуни­тета).

Противогриппозный донорский иммуноглобулин. Готовят из сыворотки крови доноров, иммунизированных живой гриппоз­ной вакциной типов А и В. Применяют для экстренной профи­лактики и лечения гриппа в эпидемических очагах.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получают путем фракционирования крови здоровых доноров. Неспецифичес­кий препарат, содержащий антитела различной специфичнос­ти. Применяют для профилактики ОРВИ (пассивный иммуни­тет).

Противовирусные препараты:

Интерферон человеческий лейкоцитарный (получают из куль­туры лейкоцитов человека, обработанных интерфероногеном); интерферон рекомбинантный; неовир и другие индукторы ин­терферона. Применяют для профилактики и лечения гриппа и других вирусных респираторных заболеваний.

Ремантадин. Назначают для профилактики и лечения гриппа в первые дни заболевания.

Рибавирин. Применяют для лечения пневмонии, вызванной РСВ.

Арилдон и другие производные 3-метил-изоксазола. Применя­ют для лечения риновирусных инфекций.

Глава 19