А Методические указания. • Микробиологическая диагностика чумы

• Микробиологическая диагностика чумы

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из бубонов, пунктат лимфатических узлов, мокрота, промывные воды же­лудка, кровь, патолого-анатомический материал.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.1). Из ис­следуемого материала готовят мазки, окрашивают по методу Грама и водным раствором метиленового синего. Y.pestis пред­ставляют собой грамотрицательные палочки овоидной формы (0,5x1,7 мкм). В мазках, окрашенных метиленовым синим, хорошо заметно биполярное распределение краски (рис. 16.1.1; на вклейке). Встречаются полиморфные клетки.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал за­севают на чашки с питательным агаром. Посевы инкубируют при 25—28 "С. Первичное изучение посевов производят через 10—12 ч. К этому сроку появляются колонии в виде батисто­вого платочка, которые образованы вирулентными R-формами. Мало- и авирулентные бактерии формируют S-формы коло­ний. Идентификацию чистой культуры проводят по морфоло­гии бактериальных клеток, характеру роста, антигенным и био­химическим свойствам, чувствительности к специфическому фагу и с помощью молекулярно-биологических методов. Иног­да также используют биопробу.

На бульоне Y.pestis образуют пленку со спускающимися ни­тями, напоминающими сталактиты; ферментируют многие са­хара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают. Y.pestis содержат групповой термостабильный соматический антиген и специфический термолабильный капсульный анти­ген, который обнаруживается только у вирулентных штаммов. В случае исследования материала, взятого у погибших грызу­нов, проводят дифференциальную диагностику с возбудителя­ми псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) на основании

характера роста на специальных средах, биохимических свойств (ферментация рамнозы, адонита) и других признаков.

Биопроба. Проводят для выделения чистой культуры из ма­териала, загрязненного посторонней микрофлорой. Наиболее чувствительными лабораторными животными являются мор­ские свинки. Материал вводят подкожно или внутрибрюшинно в том случае, если он не загрязнен другими бактериями. При контаминации посторонней микрофлорой материал втирают морской свинке в выбритый участок кожи в области живота. После гибели животных (на 3—7-й день в зависимости от способа введения материала) делают вскрытие, отмечают па­тологические изменения органов и проводят бактериологичес­кое исследование по схеме 16.1.1.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Иммунофлюоресцентный метод позволяет обнаружить присутствие антигенов возбудите­ля как в патологическом материале, так и в объектах окружаю­щей среды (вода, почва), а также в пищевых продуктах и эктопаразитах. С этой целью используют люминесцентную ви-доспецифическую противочумную сыворотку, люминесцент­ные противокапсульную и противосоматическую сыворотки. РИГА применяют для обнаружения антигенов возбудителя чу­мы в исследуемом материале с помощью стандартной проти­вочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритро­циты.

Биохимические и молекулярно-биологичес­кие исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбу­дителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствую­щих молекул можно поставить предварительный диагноз.

• Микробиологическая диагностика туляремии

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из бубонов, пунктат лимфатических узлов, мокрота, кровь, патолого-ана-томический материал.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.2). Из иссле­дуемого материала готовят мазки, окрашивают по методу Грама и метиленовым синим. Для F.tularensis характерен выраженный полиморфизм. В чистой культуре они представляют собой очень мелкие (0,3—0,5 мкм) кокки (рис. 16.1.2; на вклейке). В мазках из органов преобладают палочковидные формы. Спор не образуют, грамотрицательны, иногда выражена биполярная окраска. В биоптатах тканей и мазках F.tularensis могут распо­лагаться как вне, так и внутри клеток. Бактерии слабо окра­шиваются по методу Грама и плохо выявляются в материале

при обычных методах микроскопии. Для обнаружения использу­ют преимущественно метод иммунофлюоресценции (см. ниже).

Бактериологическое исследование. Применяют для выделе­ния чистой культуры F.tularensis. Бактериологическую диагнос­тику осуществляют в специальных лабораториях. Выделение возбудителя проводят на свернутой яично-желточной среде, глюкозоцистиновом кровяном агаре и других богатых пита­тельных средах сложного состава. Для подавления роста сопут­ствующей микрофлоры в среды добавляют пенициллин. Виру­лентные штаммы образуют S-формы колоний — мелкие, глад­кие, беловатого цвета с голубоватым оттенком. Идентифи­кацию чистой культуры проводят по морфологии бактериаль­ных клеток, характеру роста, биохимическим, антигенным свойствам и с помощью молекулярно-биологических методов. Биохимические свойства F.tularensis выявляют на специальной плотной среде с ограниченным содержанием белка. Бактерии содержат оболочечный антиген, с которым связаны их виру­лентные и иммуногенные свойства, и О-соматический антиген. По антигенным свойствам близки к бруцеллам.

Биопроба. Наиболее чувствительными животными являются белые мыши и морские свинки, которые погибают при под­кожном введении единичных бактерий.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Метод ИФ позволяет обна­ружить присутствие антигенов бактерий в патологическом ма­териале. Используют люминесцентную противотуляремийную сыворотку. В положительном случае в препарате видны светя­щиеся микроорганизмы. Антигены возбудителя в материале от больного могут быть обнаружены с помощью ИФА.

Биохимические и молекулярно-биологичес­кие исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбу­дителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствую­щих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Ставят реакцию агглютинации с туляре-мийным диагностикумом. Относительно позднее появление антител-агглютининов в крови (на 2-й неделе болезни) затруд­няет применение этой реакции для ранней диагностики, одна­ко их длительное сохранение делает возможной ретроспектив­ную диагностику. Диагностический титр реакции 1:100. Обя­зательно прослеживается нарастание титра агглютинации (в парных сыворотках). Более чувствительным методом серодиаг­ностики туляремии является РИГА, которая бывает положи­тельной в конце 1-й — начале 2-й недели заболевания. Титры антител в сыворотке в разгар заболевания достигают 1:1280— 1:2560 и выше. Используют также ИФА.

Для ускоренной диагностики применяют кровяно-капель-

ную реакцию: кровь из пальца больного наносят на обезжи­ренное предметное стекло, добавляют каплю дистиллирован­ной воды (для лизиса эритроцитов), вносят каплю диагности-кума и смешивают стеклянной палочкой. При наличии в крови агглютининов в диагностическом титре (1:100 и выше) в капле немедленно наступает агглютинация диагностикума; при тит­рах ниже диагностических агглютинация происходит через 2—3 мин.

Кожно-аллергическая проба. Для диагностики применяют внутрикожную и накожную пробы со специфическим аллерге­ном — тулярином. Пробы высокочувствительны и дают поло­жительные результаты у больных начиная с 3—5-го дня болез­ни. Положительные результаты регистрируются также у пере­болевших и вакцинированных, поэтому оценка реакции должна проводиться с осторожностью.

• Микробиологическая диагностика бруцеллеза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование (схема 16.1.3). Для получе­ния гемокультуры 5—10 мл крови, взятой из локтевой вены больного, засевают в два флакона с 50—100 мл печеночного бульона. Один из них (для выделения культуры B.melitensis) инкубируют в обычных аэробных условиях, другой (для выде­ления первичной культуры B.abortus) — в атмосфере с 10 % С0₂. В первых генерациях бруцеллы растут очень медленно, поэтому посевы выдерживают в термостате не менее месяца. В то же время рост лабораторных культур наблюдается через 1—2 сут. На агаре бруцеллы образуют бесцветные с перламут­ровым блеском колонии, в бульоне — помутнение и слизистый осадок. В мазках, окрашенных по методу Грама, обнаружива­ются мелкие (от 0,3—0,5 до 1,5 мкм) грамотрицательные кок-ковидные или более удлиненные формы (рис. 16.1.3; на вклей­ке). Они неподвижны, спор не образуют.

Для быстрой идентификации бруцелл ставят РА со специ­фическими агглютинирующими сыворотками на стекле и оп­ределяют чувствительность к специфическому фагу. Все виды бруцелл не ферментируют углеводы. Их дифференцируют по образованию H₂S, чувствительности к С0₂, способности окра­шиваться анилиновыми красителями (основным фуксином и тионином) и другим признакам. Используют также молекуляр-но-биологические методы.

Биопроба. Применяют для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой или со­держащего небольшое количество бруцелл. Исследуемый мате­риал вводят морским свинкам или белым мышам подкожно в паховую область. Мышей вскрывают через 20 дней после за-

ражения, морских свинок — через 30. Кусочки органов и лим­фатических узлов засевают на питательные среды для получе­ния чистой культуры и ее идентификации.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Чаще всего используют реакцию агглюти­нации Райта с бруцеллезным диагностикумом. Реакция доста­точно специфична. Положительные результаты отмечаются спустя 1—2 нед после начала заболевания и сохраняются у переболевших многие годы. Диагностический титр реакции 1:200. Для ускоренной серодиагностики применяют реакцию агглютинации Хеддельсона, которую ставят с неразведенной сывороткой больного и концентрированным антигеном — диа­гностикумом, окрашенным метиленовым синим.

Обезжиренное квадратное стекло размером 9x12 см делят на 5 квадратов, в которые микропипеткой вносят ингредиенты, как указано в табл. 16.1.1. Капли смешивают палочкой, начи­ная с минимальной дозы сыворотки. Стекло осторожно подо­гревают над пламенем горелки примерно до 37 °С в течение 2 мин. При положительной реакции в первые минуты появля­ются хлопья синего цвета. Реакция положительна при наличии агглютинации на "++" в дозах сыворотки 0,02—0,01 мл.

Таблица 16.1.1. Постановка пластинчатой реакции агглютинации Хеддельсона

Ингредиент		Количество материала, мл
	квадрат 1	квадрат 2	квадрат 3	квадрат 4	квадрат 5
				контроль сыво­ротки	контроль диагнос- тикума
Сыворотка Диагностикум Изотонический раствор хлорида натрия	0,04 0,03	0,02 0,01 0,03 0,03	0,02 0,03	0,03 0,03

Кроме того, для серодиагностики бруцеллеза используют РИГА, реакцию непрямой ИФ, опсонофагоцитарную реакцию, РСК, метод определения неполных антител и реакцию Кумбса и др. Эти серологические реакции обладают достаточно высо­кой специфичностью и чувствительностью. В поздние периоды

заболевания процент положительных серологических реак­ций (РА, РИГА и РСК) начинает снижаться и большее диа­гностическое значение приобретают кожно-аллергическая проба и реакция Кумбса, поэтому комплексный серо-аллерги­ческий метод является наиболее надежным в диагностике бруцеллеза.

Кожно-аллергическая проба (реакция Бюрне). На ладонную поверхность предплечья внутрикожно вводят 0,1 мл бруцелли-на. При наличии ГЗТ уже через 6—8 ч могут появиться гипе­ремия кожи и болезненная отечность. Учет реакции производят через 24 ч (см. рис. 10.4.1). Реакция обладает высокой чувстви­тельностью и появляется не только у больных и переболевших, но и у вакцинированных людей, в связи с чем ее диагностическая оценка должна производиться с осторожностью.

• Микробиологическая диагностика сибирской язвы

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: экссудат из очага по­ражения (сибиреязвенного карбункула), мокрота, фекалии, кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.4). Изучение окрашенных по методу Грама мазков из патологического ма­териала (экссудат, мокрота) позволяет обнаружить возбуди­теля, представляющего собой грамположительную крупную (1—2 х 6—10 мкм) неподвижную стрептобациллу. В организме больных и на белковой питательной среде микроорганизмы образуют капсулу (рис. 16.1.4; на вклейке), в неблагоприят­ных условиях (почве) — споры (см. рис. 2.2).

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал за­севают на чашки с питательным и кровяным агаром, а также в пробирку с питательным бульоном. Посевы инкубируют при 37 "С в течение 18—20 ч. В бульоне культура B.anthracis растет в виде хлопьевидного осадка; на агаре вирулентные штаммы образуют колонии R-формы, имеющие под малым увеличени­ем микроскопа вид львиной гривы или головы медузы. Авиру-лентные или слабовирулентные бактерии образуют S-формы колоний.

Для идентификации возбудителя изучают биохимические свойства и ряд других признаков (гемолитическую активность, способность к образованию L-форм и др.). B.anthracis обладает сахаролитическими свойствами, медленно разжижает желатин (в виде елочки верхушкой вниз), лишен гемолитической ак­тивности. Под действием пенициллина образует сфероплас-ты, имеющие вид жемчужин. Это явление используется для дифференциации B.anthracis от непатогенных бацилл. При­меняют также молекулярно-биологические методы идентифи­кации.

Биопроба. Исследуемый материал вводят подкожно белым мышам, морским свинкам или кроликам. Павших животных вскрывают, готовят мазки из крови и внутренних органов, делают посевы для выделения чистой культуры возбудителя. Капсульные формы B.anthracis в экссудате, полученном через 5—18 ч после заражения животного, можно обнаружить мето­дом иммунофлюоресценции (см. ниже).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Мазки из экссудата обраба­тывают противокапсульной сибиреязвенной антисывороткой, а затем флюоресцирующей антикроличьей сывороткой, мечен­ной родамином. В препаратах, содержащих капсульные бацил­лы, наблюдается желто-зеленое свечение возбудителя.

Антигены B.anthracis (секретируемые белки — "протектив-ный антиген" и токсины) в исследуемом материале из очага инфекции могут быть обнаружены с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА и др.).

Реакцию термокольцепреципитации Асколи для исследова­ния трупного материала ставят при необходимости диагности­ровать сибирскую язву у павших животных или у людей, умер­ших от неизвестной болезни, напоминающей висцеральную форму сибирской язвы, а также для определения зараженности сырья (кожа, мех, шерсть). Образцы исследуемого материала измельчают и кипятят в пробирке с изотоническим раствором хлорида натрия в течение 5—10 мин, после чего фильтруют до полной прозрачности. Преципитирующую сибиреязвенную сы­воротку получают путем гипериммунизации лошадей убитой культурой B.anthracis. Испытуемый термоэкстракт осторожно наслаивают на поверхность сыворотки в преципитационной пробирке. В положительном случае через 1—2 мин в месте соприкосновения появляется белое кольцо преципитации, что свидетельствует о присутствии в материале антигенов возбуди­теля. Контрольный термоэкстракт готовят из того же материа­ла, взятого от здорового животного (см. табл. 10.1.1).

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Кожно-аллергическая проба. Ставится на внутренней поверх­ности предплечья — внутрикожно вводят 0,1 мл антраксина. При положительной реакции через 24 ч появляются гиперемия и инфильтрат. Положительная реакция регистрируется у 90 % больных сибирской язвой, начиная со 2-й недели заболевания, и сохраняется у переболевших в течение всей жизни, в связи с чем ее диагностическая оценка должна производиться с ос­торожностью.

• Микробиологическая диагностика лептоспирозов

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, спинномозго­вая жидкость, моча.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.5). Из иссле­дуемого материала готовят препарат "раздавленная" капля и микроскопируют в темном поле зрения. В положительном слу­чае видны серебристые лептоспиры, представляющие собой подвижные изогнутые нити длиной 6—9 мкм с первичными и вторичными завитками (рис. 16.1.5). Загнутые крючкообразные концы придают лептоспирам S-образную форму. Для живых лептоспир характерны активное поступательное движение (прямолинейное), вращение на месте и перемещение по кругу. Ввиду очень слабой восприимчивости лептоспир к красителям исследуют только нативные препараты.

Бактериоскопия крови (а при менингеальных явлениях и спинномозговой жидкости) позволяет установить диагноз в ранней стадии заболевания (первые 5 дней). Однако отрица­тельные результаты не исключают лептоспирозной природы заболевания. Исследование мочи рационально проводить на­чиная с 10-го дня болезни.

Бактериологическое исследование. Культуры лептоспир вы­деляют на водно-сывороточной или фосфатно-сывороточной среде с добавлением инактивированной кроличьей сыворотки. Исследуемый материал засевают у постели больного в 3—5 про­бирок, заливают стерильным вазелиновым маслом (для огра­ничения доступа кислорода воздуха) и инкубируют при 28 "С не менее 2 мес. Поскольку при росте лептоспир среда остается прозрачной, через каждые 5—6 дней из среды готовят препара­ты для микроскопии в темном поле. Идентификацию выделен­ной чистой культуры осущест­вляют на основании морфо­логии, подвижности, культу-ральных признаков и антиген­ных свойств. Для серологичес­кой идентификации и сероти-пирования используют РА с на­бором диагностических сыво­роток. Используют также моле-кулярно-биологические методы идентификации.

Биопроба. Внутрибрюшинно
или подкожно заражают мор­
ских свинок, крольчат или зо-
Рис.16.1.5. Лептоспира в темном лотистых хомячков. Животных
поле зрения. держат под наблюдением в те-

чение месяца. При заболевании или гибели животного готовят препараты из крови, мочи, материала, полученного после вскрытия, микроскопируют их в темном поле и делают посевы для выделения чистой культуры лептоспир.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить пред­варительный диагноз.

Серодиагностика. Антитела в крови пациентов удается обна­ружить с конца 1-й недели болезни. Для их выявления исполь­зуют реакцию агглютинации-лизиса с живыми эталонными куль­турами лептоспир разных серогрупп и сероваров. Учет резуль­татов реакции проводят методом термопольной микроскопии в препаратах "раздавленная" капля в темном поле. В положи­тельном случае отмечают агглютинацию и лизис лептоспир. При этом в первых разведениях сыворотки наблюдаются пол­ное растворение лептоспир, частичный лизис или зернистое набухание, в последующих разведениях — агглютинация леп­тоспир и появление агломератов в виде паучков. Диагностичес­кий титр реакции 1:100. Максимальный титр антител (1:1000— 1:10 000 и выше) наблюдается на 15—30-й день заболевания. Ввиду того что у части переболевших антитела в высоких титрах сохраняются в течение многих лет, диагностическое значение имеет нарастание титра антител в парных сыворотках.

• Микробиологическая диагностика сапа

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из язвенных поражений, абсцессов, отделяемое из носа.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Из исследуемого мате­риала готовят мазки и окрашивают по методу Грама. В мазках обнаруживаются мелкие (2—4 х 0,5—1 мкм) грамотрицатель-ные палочки. Метод имеет ориентировочное значение.

Бактериологическое исследование. Burkholderia mallei культи­вируют на простых питательных средах. Они образуют мелкие гладкие колонии, имеющие кремовую окраску, которые появ­ляются на 2—3-й день. Чистую культуру возбудителя иденти­фицируют по морфологии микробных клеток, подвижности (B.mallei неподвижны), тинкториальным, культуральным и биохимическим признакам.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае

обнаружения соответствующих молекул можно поставить пред­варительный диагноз.

Серодиагностика. Для обнаружения антител к возбудителю используют реакции агглютинации, РНГА, РСК.

Кожно-аллергическая проба. Диагностическое значение име­ет постановка кожно-аллергической пробы с маллеином (ал­лергеном, приготовленным из B.mallei).

• Микробиологическая диагностика листериозов

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, смывы из зева, спинномозговая жидкость, околоплодные воды, плацента.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. В мазках из исследуемо­го материала, окрашенных по методу Грама, обнаруживаются мелкие короткие (0,5—2x0,4—0,5 мкм) грамположительные па­лочки. Метод имеет ориентировочное значение.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал за­севают на богатые питательные среды (кровяной агар, сердеч­но-мозговой бульон и др.), применяют также селективные сре­ды с высоким содержанием NaCl, антибиотиками (полимик-син, цефтазидим) и другими селектирующими агентами. По­севы инкубируют 5—7 дней при 35 °С. На кровяном агаре характерен р-гемолиз. Идентификацию осуществляют по мор­фологии микробных клеток, культуральным и биохимическим признакам. Для видовой и внутривидовой идентификации осу­ществляют серотипирование (по жгутиковому антигену и со­матическому антигену клеточной стенки) и фаготипирование.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Для быстрого обнаружения антигенов возбудителя в мазках из исследуемого материала используют метод прямой ИФ.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика мало информативна и практически не при­меняется.

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных
Streptobacillus moniliformis

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, суставная жидкость.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. В мазках из суставной жидкости, окрашенных по методу Грама, можно обнаружить

грамотрицательные палочки, располагающиеся в виде цепочек, образующих длинные неветвящиеся нити. Метод имеет ориен­тировочное значение.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал за­севают на богатые питательные среды с высоким содержанием (не менее 10 %) нативных добавок (кровь, сыворотка или ас-цитическая жидкость). Посевы инкубируют при 35 "С в атмо­сфере с повышенным содержанием С0₂. Бактерии образуют мелкие гладкие блестящие колонии. Идентификацию осущест­вляют по морфологии и тинкториальным свойствам (грамот­рицательные палочки располагаются в виде цепочек, образую­щих неветвящиеся нити длиной до 100—150 мкм), культураль-ным и биохимическим признакам. Важным методом иденти­фикации является ГЖХ.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый ма­териал, полученный из очага инфекции, используют для обна­ружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнару­жения соответствующих молекул можно поставить предвари­тельный диагноз.

Серодиагностика. Для обнаружения антител к возбудителю используют реакцию агглютинации с парными сыворотками пациента. Диагностическим считается титр реакции 1:80 и на­растание титра антител не менее чем в 4 раза.

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных Spirillum minus

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, экссудат из очага инфекции, пунктат лимфатических узлов.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Является ведущим мето­дом диагностики. Возбудителя в нативных препаратах из ис­следуемого материала обнаруживают с помощью темнопольной микроскопии. Бактерии 3—5 мкм длиной и 0,2—0,5 мкм тол­щиной, подвижны, имеют извитую форму (2—6 завитков).

Бактериологическое исследование. Не проводится, поскольку Spirillum minus не удается культивировать in vitro.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Биопроба. Материал от больного вводят внутрибрюшинно морским свинкам. Через 7—10 дней перитонеальный экссудат и кровь зараженного животного исследуют методом темно­польной микроскопии.

• Микробиологическая диагностика пастереллеза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: отделяемое кожных язв, гной из абсцессов, кровь, спинномозговая жидкость.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. В препаратах из исследу­емого материала, окрашенных по методу Грама, обнаруживают короткие (0,3—1,5 мкм длиной и 0,15—0,25 мкм толщиной) грамотрицательные палочки овоидной формы, которые могут окрашиваться биполярно.

Бактериологическое исследование. Pasteurella multocida хоро­шо растут на простых питательных средах, через 24 ч образуют мелкие непигментированные колонии. На кровяном агаре ге­молиз нехарактерен. Чистую культуру возбудителя идентифи­цируют по морфологии микробных клеток, тинкториальным, культуральным и биохимическим признакам.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить пред­варительный диагноз.

Серодиагностика мало информативна и практически не при­меняется.

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных
Erysipelothrix rhusiopathiae

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: биоптаты поражен­ных участков кожи, отечная жидкость, кровь при септической форме инфекции.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. В препаратах из исследу­емого материала, окрашенных по методу Грама, обнаруживают мелкие (0,8—2,5 мкм длиной и 0,2—0,5 мкм толщиной) грам-положительные палочки, располагающиеся поодиночке, в ви­де коротких цепочек или образующих длинные неветвящиеся нити.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал за­севают на богатые питательные среды и инкубируют в течение 7 дней в атмосфере с повышенным содержанием С0₂. Бакте­рии образуют колонии двух типов: мелкие гладкие и крупные шероховатые, на кровяном агаре дают а \ -гемолиз. Чистую куль­туру возбудителя идентифицируют по морфологии микробных клеток, тинкториальным, культуральным и биохимическим при­знакам, внутривидовое типирование (серотипирование) осу­ществляют по соматическому антигену клеточной стенки в РА с типоспецифическими антителами.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый ма­териал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помо­щью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика не применяется.

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных Bartonella hensella

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: биоптат из поражен­ного участка кожи, лимфатического узла или органа, кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. В гистологических пре­паратах из очагов поражения, окрашенных по методу Грама, могут быть обнаружены мелкие грамотрицательные палочки, располагающиеся преимущественно внутриклеточно. Метод обладает чрезвычайно низкой чувствительностью в связи с малыми размерами возбудителя. Вероятность обнаружения бактерий повышается при использовании окраски серебрени­ем, позволяющей выявлять объекты малых размеров. Метод имеет ориентировочное значение.

Бактериологическое исследование. Бартонеллы выделяют из крови пациентов на богатых средах сложного состава (с добав­лением сердечно-мозгового экстракта, крови и других факто­ров роста) или путем заражения клеточных культур (Vero и др.). Культивирование занимает несколько недель, поскольку бар­тонеллы являются прихотливыми медленно растущими бакте­риями. Для идентификации используют серологические (реак­ция ИФ) и молекулярно-биологические методы (ПЦР, метод ДНК-зондов). Бактериологическое исследование при болезни кошачьей царапины применяется сравнительно редко по при­чине трудоемкости.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Антигены возбудителя в био-птатах из очагов поражения могут быть обнаружены методом ИФ.

Молекулярно-биологические исследования. ДНК возбудителя в биоптатах из очагов поражения и крови может быть обнаружена с помощью метода ДНК-зондов и ПЦР.

Серодиагностика недостаточно информативна, поскольку антитела часто присутствуют в крови здоровых лиц. Для обна­ружения специфических IgM в крови больных применяют ме­тод непрямой ИФ: клетки культуры Vero, зараженные тест-штаммом бартонелл, обрабатывают сывороткой крови пациен­та. Специфические IgM выявляют с помощью моноклональных антител (МКАТ) к человеческим IgM, меченных флюорохро-

мом. В положительном случае наблюдается специфическое свечение бактерий в зараженных клетках.

• Микробиологическая диагностика пситтакоза и Q-лихорад-

ки. Изложена ранее (см. тему 14.1).

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Бруцеллезный единый диагностикум. Взвесь убитых бруцелл, окрашенных метиленовым синим, применяется для серодиаг­ностики бруцеллеза в реакции агглютинации Райта и Хеддель-сона.

Туляремийный диагностикум. Взвесь убитых бактерий F.tu-larensis применяется для постановки реакции агглютинации при серодиагностике туляремии.

Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных культурой B.anthracis. Применяют для постановки реакции термопреципитации по Асколи.

Чумной бактериофаг. Используется для идентификации Y.pestis.

Сибиреязвенный бактериофаг. Применяют для идентифика­ции B.anthracis.

Бруцеллин. Фильтрат 3-недельных бульонных культур В. те-litensis, В.abortus, B.suis, убитых нагреванием. Применяют для постановки кожно-аллергической пробы Бюрне.

Тулярин. Взвесь F.tularensis (вакцинного штамма), убитых нагреванием, используется для постановки кожно-аллергичес­кой пробы.

Антраксин. Белково-полисахаридно-нуклеиновый комплекс, извлеченный при гидролизе B.anthracis, применяется для по­становки кожно-аллергической пробы.

Чумная живая сухая вакцина. Высушенная живая культура Y.pestis вакцинного штамма EV используется для активной спе­цифической профилактики чумы (создание активного имму­нитета).

Туляремийная живая сухая накожная вакцина. Высушенная живая культура вакцинного штамма F.tularensis применяется для активной специфической профилактики туляремии.

Накожная сухая живая бруцеллезная профилактическая вак­цина. Высушенная живая культура вакцинного штамма B.abor-tus применяется для активной специфической профилактики бруцеллеза (создание активного иммунитета).

Бруцеллезная лечебная вакцина. Взвесь убитых нагреванием бруцелл используется с лечебной целью, способствует десен­сибилизации организма.

Сибиреязвенная живая вакцина СТИ. Названа в честь Сани-тарно-технического института, в котором была впервые полу­чена. Представляет собой высушенную взвесь живых спор ави-

Продолжение

Возбуди-	Заболевание	Источник	Перенос-	Способ
тель		инфекции	чик	паразитизма
Coxiella	Q-Лихорадка	Многие виды	Иксодо-	Облигатные
burnetii		диких и до-	вые, гама-	внутрикле-
		машних жи-	зовые, ар-	точные па-
		вотных	гасовые клещи	разиты
Bartonella	Траншейная	Человек (?)	Платяная	Факультати-
quintana	лихорадка		вошь	вные внут­риклеточные паразиты

Тема 17.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТРАНСМИССИВНЫХ ИНФЕКЦИЙ

А План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей зоонозных ин­фекций, их патогенность, экология, особенность ин­фекций и эпидемиология вызываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика.

3. Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

▲ Демонстрация

1. Препарат B.recurrentis из крови больного, окрашенный по методу Романовского—Гимзы.

2. Микропрепараты риккетсий в пораженных клетках и из чистой культуры вакцинного штамма R.prowazekii, окрашенные по методу Здродовского.

3. Методы культивирования риккетсий в куриных эмб­рионах, культурах клеток и путем заражения живот­ных.

4. Риккетсиозные диагностические и профилактические препараты (корпускулярные и растворимые антигены, сыпнотифозная вакцина).

▲ Задание студентам

1. Микроскопировать препараты крови "толстая" капля, окрашенные по методу Романовского—Гимзы, и ма­зок, окрашенный фуксином. Сделать заключение по данным микроскопического исследования.

2. Учесть результаты реакции агглютинации риккетсий с сыворотками крови больных эпидемическим и крыси­ным сыпным тифом по данным, полученным из ла­боратории.

3. Определить титр агглютининов в реакциях с антиге-

нами из R.prowazekii и R,typhi. Сопоставить результаты и обосновать диагноз заболевания. 4. Учесть результаты РСК, поставленных для дифферен­циации первичного эпидемического сыпного тифа и рецидива (болезнь Брилля—Цинссера). Сделать за­ключение по результатам серодиагностики. ▲ Методические указания

• Микробиологическая диагностика возвратного тифа
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Основной метод лабора­торной диагностики возвратного тифа. У больного во время приступа болезни берут кровь и готовят препараты для микро­скопии. Мазки окрашивают фуксином, а препарат "толстая" капля — по методу Романовского—Гимзы. Borrelia recurrentis представляют собой тонкие изогнутые нити длиной 8—16 мкм с 4—12 завитками (рис. 17.1.1; на вклейке). В мазках они окрашиваются фуксином в красный цвет, в препарате "толс­тая" капля — в фиолетово-розовый. Кроме того, рекомендуется исследовать нативные препараты в темном поле.

Биопроба. Используют для дифференциальной диагностики эпидемического возвратного тифа от клещевого, к возбудите­лям которого чувствительны лабораторные животные. Кровью больных заражают морских свинок. Через 5—6 дней при поло­жительном результате (клещевой возвратный тиф) в крови животных появляется большое количество боррелий.

Серодиагностика имеет дополнительное значение, для выяв­ления антител применяют РСК, метод непрямой ИФ и другие реакции.

• Микробиологическая диагностика клещевого боррелиоза
Лайма

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: биоптаты из пора­женных участков кожи, кровь, спинномозговая жидкость; ге­молимфа инфицированного клеща.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. На ранних стадиях забо­левания в биоптатах из пораженных участков кожи возбудитель может быть обнаружен методом серебрения. По морфологии В. burgdorferi не отличается от других представителей рода.

Бактериологическое исследование. В.burgdorferi культивируют на жидких и плотных питательных средах сложного состава (среда Келли и др.). Для идентификации возбудителя исполь­зуют биохимические и молекулярно-генетические методы (гель-

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Возбудитель может быть обна­ружен в аспирате из высыпных элементов, а также в цитоплаз­ме моноцитов периферической крови методом иммунофлюо-ресценции. Положительные результаты удается получить в 50 % случаев заболевания.

Биохимические и молекулярно-биологичес­кие исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбу­дителя с помощью метода "зондов" и ПЦР. В случае обнару­жения соответствующих молекул можно поставить предвари­тельный диагноз.

Серодиагностика. Является наиболее распространенным и доступным методом лабораторной диагностики риккетсиозов. Для обнаружения антител в крови больного применяют реак­ции агглютинации, РКС и РИГА, непрямой иммунофлюоре-сценции, ИФА и др. (см. схему 17.1.1, тему 10.4).

Реакция агглютинации применяется при серодиагностике всех риккетсиозов и характеризуется высокой специфичнос­тью. В отличие от РСК РИГА не позволяет провести внутри-групповую дифференциацию риккетсиозов. Однако РИГА мо­жет быть использована для определения фазы заболевания, поскольку гемагглютинирующие антитела накапливаются в вы­соком титре в ходе инфекционного процесса, титр их быстро падает в период реконвалесценции, а через 6 мес после выздо­ровления они исчезают. Использование РСК в сочетании с РИГА позволяет дифференцировать текущее заболевание от перенесенного в прошлом (анамнестического).

Серодиагностика позволяет дифференцировать первичный (эпидемический) сыпной тиф от рецидива сыпного тифа (бо­лезни Брилля—Цинссера) на основании особенностей иммун­ного ответа. При первичной инфекции образуются антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М, тогда как при рецидиве антитела представлены преимущественно иммуно­глобулинами класса G. Метод ИФА позволяет избирательно выявлять противомикробные IgM или IgG в сыворотке боль­ных.

• Микробиологическая диагностика эрлихиозов

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Цитологическое исследование. В лейкоцитах периферичес­кой крови больных при окраске по методу Романовского— Гимзы могут быть обнаружены характерные гроздьевидные включения — морулы, напоминающие ягоды ежевики.

Бактериологическое исследование. Эрлихии культивируют путем заражения клеточных культур (первичные культуры мо­ноцитов собак, перевиваемые линии мышиных макрофагов, клетки HeLa, промиелоцитарные опухолевые клетки человека и др.). В зараженных клетках появляются характерные вклю­чения, которые выявляют при окраске по методу Романовско­го—Гимзы. Для идентификации используют иммунохимичес­кие и молекулярно-биологические методы (ПЦР, метод ДНК-зондов). Метод культивирования эрлихий редко применяют с диагностической целью по причине трудоемкости.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле­кулярно-биологические исследования. ДНК возбуди­теля может быть обнаружена непосредственно в крови и лей­коцитах больного с помощью метода "зондов" и ПЦР.

Серодиагностика. Антитела к антигенам эрлихий в сыворот­ке крови пациентов могут быть обнаружены с помощью метода непрямой ИФ (диагностический титр 1:40) и других серологи­ческих реакций. Необходимо помнить, что антитела в диагнос­тических титрах могут длительно сохраняться после выздоров­ления, поэтому для подтверждения диагноза применяют метод парных сывороток.

• Микробиологическая диагностика бартонеллезов

(см. тему 16.1 "Микробиологическая диагностика инфек­ций, вызванных Bartonella hensella")

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, биоптаты по­раженных органов, лимфатических узлов.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое, бактериологическое исследование, экс­пресс-методы диагностики см. тему 16.1 "Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных Bartonella hensella".

Серодиагностика. Антитела к антигенам бартонелл в сыво­ротке крови пациентов могут быть обнаружены с помощью ИФА, метода непрямой ИФ и других серологических реакций. Необходимо помнить, что антитела могут присутствовать в крови практически здоровых лиц, поэтому для подтверждения диагноза применяют метод парных сывороток. Для обнаруже­ния IgM используют метод непрямой ИФ.

• Диагностические, профилактические и лечебные
препараты

Тест-системы для диагностики возвратного тифа и болезни Лайма методом ДНК-зондов.

Флюоресцирующие антитела для диагностики возвратного тифа и болезни Лайма методом ИФ.

Название вируса

РНК-вирусы СЕМЕЙСТВО Orthomyxoviridae вирус гриппа типа А

Большинство респираторных вирусов являются высоко кон­тагиозными, легко и быстро распространяются между людьми, вызывая эпидемии и вспышки заболеваний. Диагноз в боль­шинстве случаев ставят на основании клинической картины с учетом эпидемиологической ситуации. Лабораторную диагнос­тику при респираторных вирусных инфекциях используют пре­имущественно для эпидемиологического анализа. Лаборатор­ная диагностика индивидуальных случаев осуществляется толь­ко при тяжелых формах заболевания, угрожающих жизни па­циента.

Тест-системы для серодиагностики возвратного тифа и бо­лезни Лайма методом непрямой ИФ.

Тест-системы для диагностики эрлихиозов методом ДНК-зондов.

Флюоресцирующие антитела для диагностики эрлихиозов ме­тодом ИФ.

Тест-системы для серодиагностики эрлихиозов методом ИФА.

Тест-системы для серодиагностики эрлихиозов методом не­прямой ИФ.

Антибиотики: пенициллины, тетрациклины, хлорамфеникол, фторхинолоны, макролиды и др.

Глава 18