Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают. Приготовление мазков. Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла. Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гиой, моча, кровь и др.) и из органов трупов.. Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала. 1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала (моча, лик-вор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету. 2. Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови.
Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла (рис. 3). Толщин-а мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно-приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении. 3. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца.
Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край. 4. Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу., После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую часть. 5. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред.
На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу (1). 6. Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем со-скоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.
Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу несколько раз последовательно, получая таким образом ряд мазков-отпечатков. Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы. Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти.
При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога. Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения (табл. 4). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе. Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, предложенной А. И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски. Рецепты приготовления красок и реактивов, применяемых при окраске бактериальных препаратов, даны в приложении (с. 341). Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2X2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла.
При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой. Окраска мазков растворами к р а с и тел е й. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциа-новый или кристаллический фиолетовый) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую частицы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор красителя.
Техника приготовления мазков
Полученное количество материала не всегда определяет возможности диагностики, иногда очень малое количество материала является достаточным для постановки диагноза. Наличие большого количества крови часто является помехой. При её наличии мазки необходимо делать как можно скорее, иначе наступает свертывание и из свернувшегося сгустка очень трудно сделать мазки и провести исследование.
Материал наносят на стекло и очень аккуратно делают мазки, т. к. клетки очень ранимы, а наличие большого количества разрушенных клеток мешает правильной диагностике.
Правильно приготовленный мазок из нормальной или патологической измененной ткани должен отвечать следующим условиям:
- Мазок должен начинаться на 1 см от узкого края предметного стекла и заканчиваться примерно в 1,5 см от другого края предметного стекла; мазок не должен достигать длинного края стекла, между мазком и краем предметного стекла должно оставаться расстояние примерно 0,3 см.
- Хороший мазок должен быть максимально тонким (максимально приближающимся к однослойному), равномерной толщины (не волнообразным) на всём протяжении.
- Мазок из осадка жидкого материала (жидкость из серозной полости, смыв из различных органов, содержимое кистозной полости и т.п.) должен заканчиваться у одного из узких краёв предметного стекла в виде следа, оставленного как бы тонкой щёткой.
- Клетки в мазке должны быть равномерно распределены, все участки мазка должны хорошо просматриваться и не содержать «толстые участки», содержащие непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток.
Из жидких пунктатов мазки готовят подобно мазкам крови, если полученная масса плотная или комковатая, то помимо мазков можно приготовить и отпечатки на стекле.
Метод отпечатков имеет определенные преимущества.
- Во-первых, клетки подвергаются гораздо меньшему травматизму.
- Во-вторых, есть возможность расположения клеток пластами, что помогает при описании цитологического препарата характеризовать и соотношение клеток между собой.
- В-третьих, если материал богат кровью, его необходимо нанести на стекло и тогда выбирать оттуда "беленькие крупинки" и ими делать мазки.
Метод отпечатков применим при использовании цитологического метода во время операционного вмешательства, а так же получении биопсии. Этот метод может быть использован, как самостоятельно, так и параллельно с гистологическим анализом. В этих случаях помимо пункций проводят получение отпечатков с удаленных или обнаженных органов, с помощью прикосновения стекла предметного к исследуемой ткани. Так же можно готовить препараты при получении материала методом соскоба.
Жидкости, полученные при пункции, тут же центрифугируют, далее сливают верхний слой из центрифуги, а из осадка делают мазки, которые и подвергают цитологическому исследованию. В некоторых случаях приготовленные препараты можно просмотреть под микроскопом, однако диагностику патологии необходимо проводить только по окрашенному препарату.
Для дифференциальной диагностики используют цитохимические методики. Чтобы установить характер секреции и межуточного вещества, используют окраски, применяемые в гистологии (мукармин для выявления слизи, окраска пикрофуксином для выявления коллагена, остеоида).
Если материала достаточно, клетки сохраненные, хорошо приготовлен и окрашен препарат, дается заключение о гистологической форме с указанием степени дифференцировки (низкодифференцированная аденокарцинома, плоскоклеточный ороговевающий рак). В тех случаях, когда материал и цитологическая картина недостаточно убедительна для установления конкретного диагноза, дается описание препарата, отдельных клеточных элементов и, при возможности, их оценка.
Необходимой предпосылкой для точной оценки морфологических особенностей клеток в мазке является правильно сделанный, качественно фиксированный, хорошо окрашенный и методологически корректно изученный мазок, поступающий в лабораторию в сопровождении необходимых клинико-инструментальных и анамнестических данных. Невыполнение этих условий ведет к неправильному распределению клеток ткани, неполному выявлению их морфологических особенностей, «пропуску» важной диагностической информации на предметном стекле или отсутствию корригирующей клинической информации и, тем самым, к ошибочной оценке цитологической картины, а значит к неполноценному или ошибочного диагнозу. Если мазки были приготовлены вне лаборатории, то в соответствии с теми же требованиями оценивается их макроскопический вид. Сотрудники лаборатории должны постоянно обучать представителей клинических отделений, участвующих в приготовлении мазков.
Приготовление стекол
Стекла для приготовления цитологических препаратов должны быть чистые, обезжиренные и сухие.
1. Стекла тщательно промывают щеткой в теплой мыльной (или с моющим средством) воде.
2. Основательно промывают в проточной теплой воде.
3. Затем кипятят 1—2 часа в воде с добавлением соды (2—3%) или моющего средства.
4. После хорошо ополаскивают в чистой горячей воде и промывают в проточной (1—2 часа).
Обработанные и промытые в воде стекла протирают мягкой тряпкой, держа стекла за края, и хранят в смеси Никифорова (равные части 96° спирта и эфира). По мере надобности пинцетом извлекают стекла из смеси Никифорова и протирают сухой тряпкой. Обработанные таким образом стекла могут быть использованы для приготовления цитологических препаратов.
Для проведения цитохимических исследований очень хорошие результаты дает обработка предметных стекол и других стеклянных предметов в хромовой смеси следующего состава:
Двухромовокислый калий (бихромат калия) — 100 г; вода горячая — 1000 мл; неочищенная серная кислота — 100 мл.
Для приготовления хромовой смеси растворяют в горячей воде двухромовокислый калий, затем охлаждают раствор и после этого добавляют серную кислоту. Кислоту льют осторожно (обязательно в вытяжном шкафу), при этом смесь весьма сильно нагревается и приобретает темно-коричневый цвет. В этом составе предметные стекла и другую стеклянную посуду выдерживают 2—3 дня, а после промывают в проточной воде в течение 1—2 часов.
На хорошо обезжиренном предметном стекле вода должна растекаться тонким слоем, а не собираться в капли.
Фиксация
Фиксация мазка проводится в соответствии с методикой, обусловленной биологическим материалом, взятием для цитологического исследования (влажная фиксация биологического материала или подсушивание его на воздухе). При влажной фиксации приготовленный мазок помещается в фиксирующую жидкость, затем подсушиваем на воздухе. Недостаточная фиксация мазка ведет к некачественному окрашиванию клеток.
- Правильная фиксация мазка обусловливает стойкость клеток по отношению к содержащейся в красках воде, которая в нефиксированном мазке изменяет строение клеточных элементов. При фиксации мазка происходит коагуляция белка, в результате чего клетки прикрепляются к предметному стеклу;
- При фиксации цитологических препаратов должны использоваться фиксаторы: метиловый спирт, этиловый спирт, смесь Никифорова, фиксатор Май- Грюнвальда, фиксатор Лейшмана, ацетон (для иммунноцитохимии).
Если это специально не оговорено методикой, то, как правило, фиксируют высушенные мазки. Лучшим фиксатором для цитологических препаратов является метанол. В метаноле фиксацию проводят от трех до десяти минут.
Кроме того, для фиксации может быть использован этиловый спирт 100°. Время фиксации составляет 10—30 минут.
В качестве фиксатора может использоваться смесь Никифорова (время фиксации минимум 15 минут, максимум 1—2 часа). Некоторые красители (Лейшман, Май-Грюнвальд) являются одновременно фиксаторами.
Приготовление абсолютного спирта.
Для приготовления абсолютного спирта в лабораторных условиях используются прокаленный (безводный) медный купорос.
Приготовление безводного купороса. Берут химически чистый синий купорос (если он крупнокристаллический, то его предварительно толкут в фарфоровой ступке) и прокаливают в фарфоровой чашке. В результате прокаливания происходит удаление кристаллизационной воды из молекулы медного купороса (CuSO4*5H2O) и получается безводный купорос белого цвета (CuSO4). При соприкосновении с водой такой безводный купорос вновь жадно поглощает воду и дает первоначальное соединение синего цвета, на чем и основано его применение для обезвоживания спирта.
Прокаливание ведут с соблюдением известных предосторожностей, а именно: мелко размельченный купорос небольшими порциями прокаливают на малом огне через асбестовую сетку в фарфоровой чашке (или медной посуде) при постоянном помешивании фарфоровой или стеклянной лопаткой. Нельзя пользоваться металлическим шпателем и вести прокаливание в железной или никелированной посуде. Несоблюдение указанных правил может повести к пережиганию, точнее, к разложению медного купороса с образованием окислов меди (CuO). Последнее обстоятельство весьма неблагоприятно сказывается на способности купороса поглощать воду.
Хорошо и осторожно прокаленный медный купорос должен быть совершенно белым или слегка голубоватым: при перекаливании он приобретает серый цвет. Пережженный купорос при соединении с водой дает грязно-зеленые тона, что является нежелательным, ибо затрудняет контроль за ходом обезвоживания спирта. Очень хорошо вести прокаливание купороса на электрической плитке малой мощности или даже в термостате при температуре 60—70°; в этом последнем случае мелко растолченный купорос рассыпают тонким слоем на картоне. Прокаливание в термостате при 60—70° идет медленно, около 3 недель (при ежедневном перемешивании), а при температуре 100° — в течение 1—2 дней (в фарфоровой чашке).
При прокаливании медный купорос начинает отдавать кристаллизационную воду уже при температуре 60°, а при 100° частично разлагается и становится серым.
Прокаленный купорос хранят в банке с притертой пробкой.
Для приготовления абсолютного спирта прокаленный белый купорос насыпают в большую широкогорлую банку и заливают 90° спиртом из такого расчета, чтобы столб спирта над купоросом превышал толщину слоя последнего не больше чем в 4—5 раз. Содержимое банки ежедневно взбалтывают в течение 4—5 дней, добиваясь посинения всей толщи оседающего купороса. После этого в банку подсыпают еще порцию белого купороса, но уже в меньшем количестве, примерно в 2—3 раза, и оставляют на 1—2 дня. Подсыпание купороса повторяют до тех пор, пока последняя порция его не перестанет синеть, тогда абсолютный спирт считается готовым. Такой абсолютный спирт хранится постоянно на медном купоросе и используется по мере надобности для различных целей.
Если обезвоживанию подвергается 95—96° спирт, то (прокаленный) купорос приходится добавлять не больше 1—2 раз, и выход абсолютного спирта в этом случае будетсоставлять около 60—70%. Относительно небольшой выход абсолютного спирта объясняется тем, что значительная часть его остается на купоросе.
Окраска цитологических препаратов
Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать клеточные элементы мазка и оценить их особенности при микроскопии. В адекватно окрашенном мазке структуры цитоплазмы, ядра, ядерного хроматина, ядрышек окрашены элективно.
- При применении любой методики окрашивание мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки времени в течение процесса окрашивания.
- Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски. Это обязывает опытным путём установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, который устанавливает при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (рН 6,8 – 7, 2) что обеспечивается использованием буферных растворов.
- Рекомендуемые методы окрашивания цитологических мазков: азур – эозиновый, по Романовскому – Гимзе, Лейшману, Маю – Грюнвальду, Паппенгейму; гематоксилин – эозиновый, метод Папаниколау.
- Для уточнения диагноза рекомендуется использование цитохимических и иммуноцитохимических методов анализа в соответствии с принятыми методиками.
| |
2015-06-10
2408
