2015-06-10
1378
О вовлечении митохондрий в реакции обонятельных клеток на аммиак и сероводород свидетельствуют исследования собственной флуоресценции НАДН и ФП.
Под действием аммиака она усиливалась, причем сильнее реагировали пиридиннуклеотиды, то есть увеличивалась степень их восстановленности. Известно, что высокая степень восстановленности никотинамидадениндинуклеотида в митохондриях является причиной блокирования цикла Кребса на уровне НАД-зависимых ферментов митохондриального матрикса: изоцитратдегидрогеназы, альфа-кетоглутаратдегидрогеназы и малатдегидрогеназы (Лукьянова и др., 1982; Савина, 1992).
Действие ротенона на обонятельную выстилку выявило реакции, подобные аммиаку. Он, как и одорант, восстанавливал пиридиннуклеотиды и окислял или восстанавливал флавопротеиды. Как известно, ротенон является ингибитором окисления НАДН- и НАД-зависимых субстратов (пирувата, глутамата, альфа-кетоглутарата) и подавляет клеточное дыхание, блокируя перенос электронов с флавопротеидов на убихинон. Такое сходство ответов обонятельной выстилки на два разных агента, очевидно, говорит о том, что аммиак и ротенон обладают сходным механизмом действия: подобно ротенону, аммиак ингибирует клеточное дыхание и делает это непосредственно - без участия внутриклеточных сигнальных систем.
Показано (Szerb, Butterworth, 1992), что аммиак, будучи неполярным веществом, обладает липофильностью и хорошо проникает через мембраны. Вместе с тем известно, что действие нейтральных ароматических соединений, проникающих в гидрофобные участки дыхательной цепи митохондрий, направлено на нее, тогда как заряженные молекулы, неспособные проникнуть в гидрофобные участки электрон-транспортной цепи, преимущественно ингибируют дегидрогеназы субстратов (Ратникова, Ягужинский, 1972).
В.Г.Смирнова и соавторы (1972) исследовали вещества ароматического ряда, которые тормозят окисление митохондриями НАД-зависимых субстратов в присутствии акцептора фосфата (состояние 3). Они обнаружили, что местом действия этих ингибиторов является участок дыхательной цепи, расположенный между НАДН и цитохромом в. Эффект изученных веществ сходен по характеру с действием такого ингибитора, как ротенон. Оказалось, что чем выше растворимость вещества в липидах, тем эффективнее он действует в качестве ингибитора транспорта электронов. По мнению этих авторов, многие вещества, хорошо растворимые в жирах, при попадании в клетку в первую очередь должны специфически ингибировать окисление НАД-зависимых субстратов митохондриями.
Известно, что аммиак в виде NH3.6H2O (в таком виде он находится в нашатырном спирте, который являлся источником аммиака в наших опытах) легко проникает через плазматическую и митохондриальную мембраны. Совместными исследованиями химиков и физиологов показано, что аммоний является структурным хамелеоном – он существует в растворах, по меньшей мере, в виде трех соединений: четвертичного иона аммония, аммиака и аммиак-гидрата (Szerb, Butterworth, 1992). Два последних соединения, будучи неполярными, обладают липофильностью и хорошо проникают через мембраны. При увеличении концентрации аммония содержание липофильных форм возрастает.
При обдувании обонятельной выстилки аммиаком в обонятельной слизи, по-видимому, создается кратковременный избыток этого одоранта. Это означает, что над обонятельным эпителием повышается содержание гидрофобных аммонийных компонентов, проникающих в митохондрии. Четвертичный ион аммония не попадает в эти органеллы извне, поскольку их мембраны непроницаемы для NH4+. Пройдя в митохондриальный матрикс, аммонийные соединения сохраняют свой структурный дуализм, а, следовательно, образуют и ион аммония.
Вероятно, с этим связано его двойное действие на окислительный метаболизм: с одной стороны, он ингибирует клеточное дыхание, подобно ротенону, проникая в гидрофобные участки дыхательной цепи, а с другой, – влияет на активность митохондриальных ферментов. Действительно, ион аммония подавляет активность НАДН-и НАД(Ф)Н-зависимой изоцитратдегидрогеназы, митохондриального альфа-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса при физиологических концентрациях, ингибирует ФАД-зависимые дегидрогеназы (Lai, Cooper, 1991; Венедиктова и др., 2001). Под влиянием аммиака в изолированных митохондриях мозга нарушается энергетический обмен, истощаются запасы АТФ, ингибируется Na+/Ca2+-обмен, блокируется захват Са2+ митоходриями, что, в свою очередь, инициирует накопление этого иона в цитозоле (Jessy et al., 1990; Косенко и др., 2001; Фелипо и др., 2001).Таким образом, в этих опытах продемонстрировано прямое действие аммиака на митохондрии.
Принимая во внимание эти свойства аммиака, можно предположить, что и в обонятельных клетках NH3 проникает в гидрофобные участки дыхательной цепи митохондрий и действует на окислительный метаболизм, ингибируя активность дыхательной цепи митохондрий, подобно ротенону. С другой стороны, в виде иона аммония, образующегося в митохондриальном матриксе из проникшего туда аммиака, он ингибирует также дегидрогеназы субстратов. Кроме того, под влиянием аммиака в митохондриях нарушается энергетический обмен, блокируется захват кальция митохондриями.
Вероятно, повышение кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток под действием аммиака обусловливается ингибированием окислительного метаболизма в них, что сопровождается истощением митохондриального кальция и накоплением его в цитозоле.
Количество этого иона, связанного с внутренней мембранной поверхностью, коррелирует с аккумуляцией мембранами, как это показано на эритроцитах (Орлов, Шевченко, 1978). В свою очередь, содержание ионов кальция в этой области может варьировать вследствие изменения его внутриклеточной концентрации, изменения величины константы связывания кальция, изменения конформационного состояния мембраны и свойств микроокружения в зонах связывания Са2+, а также изменения числа участков связывания Са2+. На мембране эритроцитов ими являются карбоксильные группы белков, связывающие 60 - 70% мембранного кальция и локализованные в основном на внутренней стороне мембраны кислые фосфолипиды (Орлов, Шевченко, 1978). В свою очередь, в зависимости от состояния мембраны и изменений условий вне- и внутриклеточной среды количество типов и участков связывания Са2+ меняется, а тем самым изменяется общее содержание кальция в мембранах (Курский и др., 1977).
Важно отметить, что усиление интенсивности флуоресценции комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ под действием аммиака связано не только с увеличением концентрации внутриклеточного кальция, но и с изменением свойств плазмолеммы, поскольку показано, что он увеличивает степень ее поляризации и снижает текучесть, а следовательно, увеличивает ее жесткость (Kashiwaynagi, Kurihara, 1985).
Вероятно, с опустошением митохондриального кальциевого депо можно связать снижение или исчезновение реакции на одорант на фоне ротенона и FCCP. Известно, что FCCP блокирует захват Са2+ митохондриями. Под его действием этот ион высвобождается из них (Limmermann, 2000). Показано, что уже через 30 с после его аппликации концентрация кальция в цитозоле увеличивается за счет выхода из органелл (White, Reinolds, 1997). Поскольку аммиак сам приводит к высвобождению кальция из митохондрий, то суммарный его эффект с ингибитором клеточного дыхания и разобщителем окислительного метаболизма истощает запасы Са2+ в них. В результате при стимуляции NH3 реакция снижается вплоть до исчезновения.
Таким образом, в отличие от одорантов первой группы, в обонятельную рецепцию аммиака не вовлекаются внутриклеточные сигнальные системы. Механизм его действия направлен непосредственно на митохондрии, по-видимому, в начальном участке дыхательной цепи – в области комплекса I.
Стимуляция обонятельной выстилки сероводородом вызывала либо небольшое нарастание интенсивности собственной флуоресценции НАДН, либо не изменяла ее. Одорант-зависимое окисление флавопротеидов при этом также было либо незначительным, либо не происходило вовсе. Реакции развивались очень медленно, достигая максимума более, чем за две минуты. Слабые реакции компонентов дыхательной цепи митохондрий на сероводород или отсутствие их может, вероятно, свидетельствовать о том, что под действием гнилостного запаха подавляется межмолекулярный транспорт электронов по дыхательной цепи.
Аналогичным влиянием обладает ингибитор терминального окисления – азид натрия, который, как и сероводород, повышает степень восстановленности пиридиннуклеотидов. Следовательно, выявлено определенное сходство в действии на клеточное дыхание азида натрия и H2S. Меркаптан, подобно ингибиторам терминального участка дыхательной цепи, проникая в митохондрии, по-видимому, угнетает клеточное дыхание обонятельных клеток, действуя непосредственно. Однако складывается впечатление, что сероводород и азид натрия имеют разные пункты (“мишени”) действия в электрон-транспортной цепи митохондрий.
Как показали наши эксперименты, азид натрия, в отличие от одоранта, всегда изменяет окислительно-восстановительное состояние не только НАДН, но и ФП, что указывает на сохранение транспорта электронов между ними. Для ингибиторов терминального участка электрон-транспортной цепи митохондрий свойственно неполное угнетение клеточного дыхания. Так, 3 мМ цианистый калий в срезах печени на 70 - 80% угнетает окислительный метаболизм. При этом сохраняется остаточное дыхание, связанное главным образом с немитохондриальными системами окисления, такими как ферменты микросомального окисления, включая, цитохром Р450 (Лукьянова и др., 1982).
Что касается H2S, то в 64% случаев обдувание им обонятельного эпителия прекращало электронный транспорт по дыхательной цепи. Приведенные данные свидетельствуют о том, что сероводород, в отличие от азида натрия, блокирует перенос возбужденных электронов не только на конечном, но и на начальном участке дыхательной цепи митохондрий.
Известно, что сероводород так же, как и аммиак, хорошо проникает через плазмолемму и внутреннюю мембрану митохондрий. Он является сильным дыхательным ядом, вызывающим тканевую аноксию вследствие блокады железо- и медьсодержащих ферментных систем. Поэтому считалось, что его действие направлено главным образом на терминальный участок дыхательной цепи митохондрий. Здесь локализуется цитохромоксидаза, переносящая электроны на О2 с образованием воды. Она представляет собой интегральный белок внутренней митохондриальной мембраны. Функциональная единица фермента состоит из 4 одноэлектронных центров: двух гемов (в цитохроме а и цитохромоксидазе) и двух атомов Cu (Лукьянова и др., 1982). Сероводород за счет связывания с Cu в цитохромоксидазе блокирует перенос электронов на кислород. Но в составе цитохрома а и цитохромоксидазе присутствует железо, поэтому, вероятно, под действием H2S электроны не могут перейти с одного цитохрома на другой (Reynafarje, Feffeira, 2002).
Однако есть все основания полагать, что действие сероворода на клеточное дыхание не ограничивается только цитохромоксидазой. Известно, что имеется два основных участка поступления восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь от субстратов: НАД- и ФАД-зависимый. Местом входа электронов в митохондриальную электрон-транспортную цепь является НАДН-убихиноноксидоредуктаза (комплекс I). Это самый большой дыхательный комплекс с молекулярной массой более 900 кДа и в молекуле, идентифицированной у быка, состоит из 45 различных субъединиц. Комплекс I катализирует перенос электронов с НАДН на убихинон через ряд редокс-центров, которые включают в себя флавинмононуклеотид, от 7 до 9 Fe-S-центров и до трех видов полухинонов. Под влиянием двухвалентных катионов этот комплекс может проявлять активные или неактивные свойства (Checchini, 2003).
Сероводород, как и аммиак, принадлежит к группе молекул, проникающих через клеточные мембраны. Таким образом, он способен, по-видимому, взаимодействовать с металлами в составе НАДН-дегидрогеназы, блокируя перенос электронов на комплекс II.
Можно предположить, что H2 S будет влиять на путь, который связан с окислением сукцината. В этом случае перенос протона от субстрата катализруется ферментом сукцинатдегидрогеназой (Ленинджер, 1985; Лукьянова, 1983; Chechini, 2003). Сукцинатдегидрогеназа прочно связана с внутренней мембраной митохондрий. Одна молекула этого фермента содержит один остаток ковалентно связанного флавинадениндинуклеотида и 2 Fe-S-центра. В одном из этих центров находится 2 атома Fe, а в другом - 4. Все эти атомы железа участвуют в переносе электронов в дыхательную цепь (Ленинджер, 1985). Как видно, сероводород способен, вероятно, “перекрыть” и этот путь электронного транспорта вдоль дыхательной цепи.
Электрон-транспортная цепь митохондрий, по-видимому, доступна для блокирующего действия сероводорода и на следующем участке – комплексе III, который состоит из убихинол-цитохром с оксидоредуктазы или цитохром вс1 комплекса. Этот комплекс в митохондриях млекопитающих состоит из 11 субъединиц, которые включают мембраносвязанный дигем цитохром в и мембрано-заякоренный цитохром с1 и [2Fe-2S]-содержащий протеин. H2S, по-видимому, может взаимодействовать с этими металлами, блокируя перенос электронов с убихинона на цитохром с (Chechini, 2003).
В последнее время большое внимание уделяется меди как металлу, влияющему на клеточное дыхание. Медь является элементом, который играет важную роль в биохимии аэробных организмов. У человека она утилизируется разнообразными, но ограниченными в числе ферментами, чтобы обеспечить возможные электрон-транспортные реакции в ключевых метаболических путях. Дефицит меди приводит к потере активности этих ферментов, снижая в результате окисление железа, образование пигмента, биосинтез нейротрансмиттеров, образование соединительной ткани и клеточное дыхание (Hamza, Gitlin, 2002).
Получены косвенные доказательства, указывающие на то, что медь может быть важной частью в функционировании АТФ-синтазы. Эти данные получены из наблюдений над животными, подвергавшимися действию Cu-диеты, и из экспериментальных данных, полученных на интактных митохондриях и с изменной АТФ-синтазой. Показано, что АТФ-синтаза регулируется естественным белковым ингибитором, который минимизирует бесполезный гидролиз АТФ в деэнергизованных митохондриях (Pedersen, 2000). Этот ингибитор (IF1) найден в стехиометрии 1:1 с энзимом и связывается с одной из бета-субъединиц и ингибирует гидролиз АТФ. Есть некоторые доказательства, что медь способна предотвращать инактивацию АТФ-синтазы посредством IF1 (Mederos, Jennings, 2002). В связи с этими данными напрашивается предположение, что связываясь с медью, сероводород может влиять и на активность АТФ-синтазы.
Таким образом, есть основания считать, что в отличие от аммиака, блокирующего перенос электронов в области комплекса I, сероводород блокирует электронный транспорт на всем протяжении электрон-транспортной цепи. Мишенью его действия, в отличие от аммиака, в начальном участке дыхательной цепи являются комплекс I, в состав которого входят НАДН-дегидрогеназа и ее Fe-S-центры и комплекс II, содержащий сукцинатдегидрогеназу и ее Fe-S-центры.
Можно полагать, что H2S способен взаимодействовать со всеми белковыми комплексами, содержащими железо, медь и серу, на всем протяжении дыхательной цепи, вплоть до АТФ-синтазы, оказывая на них непосредственное ингибирующее влияние. Столь простой и надежный механизм реагирования обонятельных клеток на гнилостные запахи, может быть, и обеспечивает необычайно высокую чувствительность человека к ним, характеризующуюся ничтожной пороговой концентрацией в воздухе (0,01 - 0,03 мг м-3).
Известно, что биологическое окисление и фосфорилирование в митохондриях сопряжены между собой. Поэтому ингибирование переноса электронов на всем протяжении электрон-транспортной цепи подавляет синтез АТФ в митохондриях. Прекращается аккумуляция кальция, истощаются его запасы в этих органеллах, что приводит к накоплению его в цитозоле.
Вероятно, с этим связано повышение интенсивности кальциевой флуоресценции в ответ на H2S и исчезновение реакции на одорант на фоне азида натрия, наблюдаемые в наших опытах.
Следовательно, у одорантов, имеющих острый и гнилостный запахи, общим в механизме действия является то, что как тот, так и другой оказывают непосредственное действие на окислительный метаболизм обонятельных клетках. Однако делают они это по-разному. Аммиак ингибирует клеточное дыхание в начальном участке дыхательной цепи, тогда как H2S блокирует транспорт электронов на всем ее протяжении (рис. 72). Это еще один аспект гетерогенности обонятельной рецепции.
4.4. Исследование влияния амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
Одоранты первой группы (амиловый спирт, камфора, цинеол. амилацетат, ванилин) также изменяли в наших опытах собственную флуоресценцию НАДН и ФП. Под действием этих одорантов она усиливалась. Такую реакцию дыхательной цепи можно, вероятно, связать с образованием избытка НАД-зависимых субстратов, обусловленным активацией пахучими веществами синтеза внутриклеточных вторичных посредников, обеспечивающих повышение степени восстановленности пула пиридиннуклеотидов в обонятельной клетке.
Однако возможен и другой механизм, связанный с увеличением содержания кальция в цитозоле, о чем косвенно свидетельствовали результаты исследования флуоресценции комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ. Одной из причин роста интенсивности флуоресценции НАДН и ФП при увеличении содержания ионов кальция в цитозоле может быть активация малат-аспартатной челночной системы в митохондриях. Существует прямая корреляция между захватом Са2+ митохондриями и интенсивностью собственной флуоресценции НАДН (Лейкин, Виноградов, 1974; Duchen, 2000; Mederos, Jennigs, 2002).
Считают, что индуцируемая кальцием проницаемость митохондриальной мембраны для пиридиннуклеотидов может быть дополнительным путем обмена восстановленных эквивалентов между матриксом митохондрий и цитозолем (Лейкин, 1977). Вероятно, с переносом НАДН в митохондрии можно связать рост интесивности его флуоресценции при увеличении концентрации внутриклеточного Са2+, поскольку при этом образуется комплекс Са2+-НАДН, имеющий высокий квантовый выход люминесценции (Лейкин, 1977; Преображенский, Денисов, 1977).
Можно предположить проникновение восстановительных компонентов в матрикс митохондрий через РТР- или МРТ-пору (mitochondrial permeability transition). Она образуется в результате деформации комплекса молекул, который собирается в областях контакта наружной и внутренней митохондриальной мембраны. В его состав входит потенциал-зависимый анионный канал (VDAC), располагающийся в наружной мембране митохондрий., где он образует пору диаметром 2,5 – 3,0 нм. Вторым компонентом этого комплекса является транслоказа адениновых нуклеотидов (ANT), локализованная во внутренней митохондриальной мембране. VDAC и ANT могут тесно взаимодействовать друг с другом с образованием комплекса, который способен рекрутировать дополнительные протеины, одним из которых является циклофилин D (СyPD). Он локализуется в матриксе митохондрий (Crompton, 2000).
Эта пора представляет собой высокопроводимый неселективный канал (Rizutto et al., 2000). Через него к транспортной системе митохондрий могу проникать вещества с молекулярной массой до 1500. Активация проницаемости этой поры вызывается ионами кальция, захваченными митохондриями (Hajnoczky et al., 2000; Azarashvili et al., 2002). В результате этого каналы обеспечивают генерализованную проницаемость внутренней мембраны митохондрий, индуцируемую ионами кальция. Открывание РТР характеризуется большим числом субпроводимости (O`Rouke, 2000).
Показано, что при повышении пула восстановленных пиридиннуклеотидов в матриксе митохондрий резко увеличивается потребление кислорода, то есть активируется клеточное дыхание (Mederos, Jennigs, 2002).
Как выявили результаты наших исследований, стимуляция обонятельной выстилки амилацетатом, амиловым спиртом, камфорой, цинеолом и ванилином инициирует вход кальция в цитозоль, а при повышении его внутриклеточного содержания он быстро аккумулируется митохондриями (Гайнутдинов, 1972: Rassmussen, Barret, 1988; Rizzuto et al., 1993; White, Reinolds, 1997; Pozzan, Rizzuto, 2000). Для этого необходима близость или даже контакт между митохондриями и источником локального повышения кальция (Rizzuto, 1993; Pozzan, Rizzuto, 2000).
Однако из данных ультраструктурных исследований обонятельных клеток видно, что эти органоиды не содержатся в обонятельных жгутиках, а сосредоточены в области булавы и проксимальных отделов периферического отростка (Бранштейн, 1966). Вероятно, ионы кальция, вошедшие в обонятельный жгутик под действием одоранта, могут распространяться к месту скопления митохондрий, образуя здесь локальные зоны концентрированного содержания Са2+. Скорость распространения кальция в кортикальных астроцитах крысы около 25 мкм в с (Duchen, 2000). Такие сложные пространственно-временные паттерны изменений концентрации внутриклеточного кальция, вызванные стимуляцией рецептора, обнаружены во многих типах клеток (Rassmussen, Gustin, 1978; Alkon, Rassmussen, 1988; Berridge et al., 1988; Rizzuto et al., 1993; Berridge, 1997; Sham, 1997).
Захват Са2+ митохондриями управляется митохондриальным мембранным потенциалом и зависит от наличия Са2+-унипортера, активность которого увеличивается в кубической зависимости при увеличении содержания свободного цитозольного кальция (Chen, 1988; Khana et al., 1988; Hajnoczky et al., 2000; Pozzan, Rizzuto, 2000). Функция унипорта заключается в том, чтобы транспортировать Са2+ по его электрохимическому градиенту в матрикс митохондрий во время повышения его содержания в цитоплазме. Полагают, что он представляет собой канал, регулируемый двухвалентными катионами и нуклеотидами и блокируется рутениевым красным (O’Rouke, 2000).
Можно предположить, что взаимодействие пахучих веществ с мембранными рецепторами обонятельных жгутиков, активируя систему вторичных посредников, изменяет проницаемость плазмолеммы для кальция, который, в свою очередь, инициирует малат-аспартатную систему, что приводит к повышению митохондриального пула НАДН и усилению клеточного дыхания. Следовательно, увеличение флуоресценции НАДН под влиянием амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина свидетельствует об активации митохондриального дыхания обонятельных клеток.
Одной из причин усиления флуоресценции НАДН и ФП при увеличении содержания ионов кальция в цитозоле может быть активация кальцием митохондриальных ферментов. Показана прямая корреляция между концентрацией митохондриального кальция и увеличением уровней НАДН, продукцией митохондриального АТФ и активацией энзимов в этих органеллах (Duchen, 2000; Rizzuto et al., 2000; Pozzan, Rizzuto, 2003;). Основными мишенями пути импорта кальция в митохондрии являются дегидрогеназы цикла трикарбоновых кислот, которые им активируются, и, в частности, сукцинатдегидрогеназа (Duchen, 2000).
Войдя в цитозоль из интерстиция, Са2+ усиливает окисление сукцината и повышает интенсивность митохондриального дыхания, что сопровождается возрастанием уровня НАДН (Лейкин, Виноградов, 1974; Akerman, 1981). Считают, что в живой клетке, где агонист-зависимое повышение цитозольного Са2+ происходит параллельно повышению уровней восстановленных НАДН, нарастание содержания этого иона в митохондриях может увеличить доступ восстанавливающих эквивалентов к дыхательной цепи (Pralong et al., 1994; Rizzuto et al., 1994; 2000). При этом увеличение НАДН, сопряженное с повышением внутриклеточного Са2+, в стимулируемых клетках, в свою очередь активировало синтез АТФ в митохондриях и, следовательно, увеличение его содержания в цитозоле. Это обусловливалось увеличением активности митохондриальной АТФ-синтазы, зависимой от концентрации матричного кальция (Jouaville et al., 1999).
Показано, что модуляция продукции АТФ в клетках появляется с определенной функционально значимой микрогетерогенностью. Так, микродомены АТФ могут существовать вблизи Са2+-насосов эндоплазматического ретикулума или концентрироваться в субплазматическом пространстве и в митохондриях, а не во всей цитоплазме (Landolfi et al., 1998; Kennedy et al., 1999). Этот путь стимуляции окислительного метаболизма в обонятельных клетках кажется более вероятным. Причина усиления интенсивности флуоресценции НАДН и ФП при увеличении содержания кальция внутри клетки, которые мы регистрировали в ответ на стимуляцию одорантами первой гуппы, может заключаться в активации кальцием сукцинатдегидрогеназы и переходе на окисление сукцината.
Вероятно, активирующее действие пахучих веществ можно объяснить наличием ротенонрезистентного пути восстановления НАД в обонятельных клетках. Показано, что на фоне ротенона может происходить увеличение дыхательного контроля сукцината за счет того, что в присутствии последнего происходит практически полное восстановление дыхания, подавленного ингибитором, до тех значений, до которых он его стимулировал без ротенона или даже выше (Лукьянова и др., 1982). С этим, по-видимому, связано учащение двигательной активности жгутиков при стимуляции амилацетатом (Бронштейн, 1977).
В пользу данного предположения свидетельствует и то, что в области булавы периферического отростка обонятельных клеток земноводных отмечается высокая активность сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, а также значительное содержание белков, богатых карбоксильными и сульфгидрильными группами (Бронштейн, 1977).
Эти энзимы остаются активированными даже при снижении уровня цитозольного кальция (Rassmussen, Barret, 1988), что связано, очевидно, с темпами обмена кальция между цитозолем и митохондриями. Концентрация этого иона в митохондриальном матриксе остается повышенной в течение десятков секунд после того, как его уровень в цитоплазме вернется в исходное состояние (Hajnoczky et al., 1995; White, Reinolds, 1997; Drummond et al., 2000; Duchen, 2000; Hainoczky et al., 2000; Rizzuto ey al., 2000;). Видимо, поэтому при стимуляции обонятельных клеток амиловым спиртом, амилацетатом, камфорой, ванилином и цинеолом продолжительность реакции усиления собственной флуоресценции НАДН и ФП была гораздо дольше времени усиления флуоресценции комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ, то есть процесс активации митохондриального дыхания длился дольше, чем динамика мембраносвязанного кальция.
Повышение активности сукцинатдегидрогеназной системы митохондрий является весьма чувствительной характеристикой состояния клеточного дыхания при изменении физиологического сосотояния организма в условиях воздействия факторов среды (Васин, Королева, 2001). Усиление окисления сукцината является основой компенсаторных восстановительных процессов при нормальных физиологических условиях. При переходе ткани в активное состояние, когда необходимо усиление продукции энергии, в системе окисления происходит перестройка на преимущественное образование и использование сукцината. Переход на сукцинат позволяет повысить мощность системы окислительного фосфорилирования, то есть скорость выработки АТФ (Кондрашова, 1970; 1971; 1972). Это связано со стимуляцией митохондриального дыхания активированными дегидрогеназами, увеличивающей мебранный потенциал митохондрий и управляющей увеличением продукции АТФ (Duchen, 2000).
Таким образом, одоранты с камфорным, эвкалиптовым, прогорклым, цветочным и фруктовым запахами активируют клеточное дыхание, причем его стимуляция сопряжена с повышением содержания ионов кальция в цитозоле (Drummond et al., 2000). В обонятельных клетках увеличение содержания Са2+обусловлено его входом из внеклеточной среды, инициируемым одорантами. По-видимому, с транспортом этого иона связаны как генерация рецепторного потенциала на мембране жгутиков, так и стимуляция дыхательной цепи митохондрий рецепторных клеток.
Чтобы ответить на вопрос, оказывают ли эти одоранты свое влияние на митохондриальное дыхание непосредственно или через систему вторичных посредников, мы проводили эксперименты с использованием ингибиторов аденилатциклазы – 2,5-дидеоксиаденозина и фосфолипазы С – неомицина. При ингибировании основных ферментов сигнальных путей стимуляция амиловым спиртом, камфорой, цинеолом, амилацетатом и ванилином в одной части опытов вызывала резкое ослабление динамики окислительно-восстановительных процессов в митохондриях, а в другой части опытов изменений окислительного метаболизма не наблюдалось.
Сохранение реакции митохондрий на одоранты, когда ферменты, синтезирующие вторичные посредники, не функционируют, можно, вероятно, связать с активностью G-белка, поскольку ингибировались эффекторные молекулы, которые в цепи передачи сигнала локализуются после него. Предположение основано на том, что обдувание обонятельной выстилки камфорой и цинеолом не инициировало изменений окислительного метаболизма на фоне ингибиторов соответственно фосфолипазы С и аденилатциклазы. Но, как следует из наших данных, механизм трансдукции именно этих одорантов не вовлекает в обонятельную рецепцию G-белок.
Основную роль во взаимодействии ГТФ-связывающих белков с белками-мишенями приписывали альфа-субъединице G-протеинов. Однако в последнее время обнаруживаются новые функциональные свойства у бета-гамма-димера G-протеина. Он активирует К+-селективный ионный канал в клетках предсердий, взаимодействует и активирует некоторые эффекторы, включая ФЛС-бета2 и бета3, аденилатциклазу, Са2+-каналы. Таким образом, G-бета-гамма димер обладает своей специфической сигнализацией, причем он способен обеспечить большое разнообразие физико-химических процессов в клетке, так как обнаружено 5 различных бета- и 12 гамма-субъединиц G-белка. И если бета-гамма-димер образуется случайным образом, то возможно 60 комбинаций, причем каждое сочетание этих субъединиц будет проявлять клеточную или тканевую специфичность.
Гетерогенность, которая проявляется в свойствах этих субъединиц, обусловливается тем, что каждый эффектор контактирует с уникальной последовательностью аминокислотных остатков в активном центре молекул субъединиц G-белка. Сигнальная специфичность бета-гамма-димера G-протеина объясняется такими факторами, как дискретная субклеточная локализация эффекторов, компартментализация компонентов сигнальной трансдукции, а также экспресси сигнальных молекул, специфических для данного типа клеток (Cabrera-Vera et al., 2003). Вероятно, сохранение изменения окислительного метаболизма в обонятельных клетках в ответ на стимуляцию амиловым спиртом, амилацетатом и ванилином обусловливается способностью G-бета-гамма димера независимо взаимодействовать с эффекторными молекулами.
Возможен и другой путь. Так, например, в клетках обнаружены LIM-киназы. Их каталитическая активность направлена на Ser/Tre-остатки. Доказано, что эти киназы опосредуют внутри- и межмолекулярные протеин-протеиновые взаимодействия. Считают, что они играют специфическую роль в неизвестных сигнальных путях. У человека LIM-киназа 1 взаимодействует с ПКС-гамма и ПКС-кси, а домен LIM2 связывает LIM-киназу 1 с ПКС-гамма. ПКС-кси и ПКС-дельта являются атипичными протеинкиназами, не зависящими от кальция и диацилглицерола (Schenk, Snaar-Jagalska, 1999). Поскольку локализация компонентов сигнальных путей строго компартментализована, и они выполняют свои специфические функции в определенных участках клеток, то можно предположить, что какие-то новые пути включаются в реакцию, когда основные ферменты механизма трансдукции выключены.
Все эти косвенные факты подкрепляют предположение о том, что свое активирующее влияние на митохондрии амиловый спирт, амилацетат, камфора, ванилин и цинеол осуществляют опосредованно – через соотвествующие сигнальные системы и кальций. Причем вход кальция в клетку под действием амилового спирта, амилацетата и цинеола обеспечивается активностью аденилатциклазы, а при обонянии камфоры и ванилина – фофсфолипазы С (рис. 73).
Таким образом, рецепция одорантов, обладающих камфорным, фруктовым, цветочным, прогорклым и эвкалиптовым запахами, обеспечивается внутриклеточными сигнальными системами, что связано с изменением клеточного метаболизма, и активацией клеточного дыхания. В обоняние острых и гнилостных запахов не вовлекаются внутриклеточные сигнальные системы. Вероятно, сигнальным признаком для них является прямое ингибирование клеточного дыхания, но механизм ингибирования у острых и гнилостных запахов различен.
В принципиальных различиях действия на окислительно-восстановительное состояние дыхательной цепи митохондрий качественно разных одорантов, принадлежащих как одной группе (представлены на рис. 73) так и, в еще большей степени, двум группам, подтверждается гипотеза гетерогенности обонятельной рецепции.
Неоднородность механизмов хемотрансдукции была обнаружена во вкусовых, каротидных и медуллярных рецепторах. Так, сопоставление реакций метаболических систем клеток вкусовой луковицы на химические вещества с разным вкусом показало различие в окислительно-метаболических процессах, происходящих при восприятии горечей и кислот, с одной стороы, и сладких и соленых агентов, с другой. Метаболические системы вкусовых клеток непосредственно участвуют в кодировании информации только о горечах и кислотах. В рецепции веществ со сладким и соленым вкусами они осуществляют, вероятно, только энергетическое обеспечение кодирования, причем энерготраты вкусовых рецепторов в этих процессах невелики (Соловьев, Самойлов, 1977; 1978; Самойлов, 1983).
Подытоживая результаты исследования флуоресценции обонятельных клеток, можно заключить, что восприятие запахов разного качества обеспечивают неоднородные физико-химические процессы. Следовательно, не только вкусовой, каротидной, медуллярной, но и обонятельной рецепции присуща гетерогенность биофизических механизмов трансдукции.
