double arrow

Исследование влияния аммиака на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток


На рис. 64 а, б, представлены данные по влиянию аммиака на окислительно-восстановительное состояние дыхательной цепи митохондрий (n=13). В 92% опытов при обдувании обонятельной выстилки аммиаком синее свечение усиливалось на 2 – 11%, что свидетельствует об увеличении флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов. Своего максимума сигнал достигал через 98 с и длился более 3 минут. Следовательно, под влиянием аммиака нарастал митохондриальный пул НАДН.

В опытах было обнаружено, что аммиак в 61% случаев усиливал и желто-зеленое свечение. Реакция развивалась медленно, и через 194 с сигнал на 4% превосходил свое исходное значение, возвращение к которому занимало более 4 минут. Увеличение интенсивности собственной флуоресценции ФП в ответ на аммиак свидетельствует об одорант-зависимом повышение окисленных ФП.

Исходя из проведенных наблюдений, можно заключить, что аммиак в качестве пахучего вещества с острым запахом изменял окислительно-восстановительное состояние НАДН и ФП в митохондриях.

При сравнении кинетики реакций дыхательной цепи митохондрий, которые возникают под действием одорантов первой группы и аммиака, видно, что на аммиак реакция разворачивается гораздо медленнее, чем на одоранты первой группы. Так, например, реак
ция НАДН на амиловый спирт своего максимального значения достигает в среднем за 29 с, а через 98 с возвращается в исходное состояние. На стимуляцию цинеолом эти времена были еще короче – соответственно 8 с и 37 с, тогда как на аммиак – 98 с и 3 минуты.




То же относится и к реакции флавопротеидов. Своего макисмальной значения при обдувании амиловым спиртом она достигала через 16 с, а через 62 с прекращалась, а под влиянием цинеола времена были равны соответственно 33 с и 67 с. Аммиаку же потребовалось 194 с, чтобы реакция стала максимальной и более 4 минут для ее прекращения. Такую существенную разницу в кинетике реакций митохондрий обонятельных клеток на одоранты первой группы и аммак можно, вероятно, объяснить различным механизмом действия этих одорантов на активность дыхательной цепи митохондрий.

В связи с этим важно было выяснить механизм действия аммиака на окислительно-восстановительное состояние митохондрий рецепторных клеток. С этой целью в опытах применялся ротенон, который является ингибитором клеточного дыхания, подавляющим перенос электронов с ФП на убихинон. Мы попытались оценить реакции митохондрий обонятельной выстилки на аммиак и ротенон.

В опытах было обнаружено, что ротенон в 100% случаев до 4% усиливал синее свечение, то есть увеличивал интенсивность собственной флуоресценции НАДН (рис. 65 а). Время достижения максимума составляло до 10 с, а длительность ответа достигала 50 с, но в отдельных опытах свечение не уменьшалось в течение более 5 минут. Полученные данные свидетельсвуют о ротенон-зависимом повышении митохондриального содержания восстановленных пиридиннуклеотидов.



Как показали результаты исследований, в 100% опытов интенсивность желто-зеленого свечения увеличивалась (рис. 65 б), что обусловливалось усилением собственной флуоресценции ФП. За 30 с под действием ротенона сигнал принимал максимальное значение (7%) , а к исходному уровню возвращался через 3,5 минуты и дольше. Приведенные данные свидетельствуют о том, что ротенон индуцировал повышение митохондриального содержания восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеидов.

Таким образом, ротенон и аммиак индуцировали сходные реакции митохондриального дыхания обонятельных клеток – оба вещества повышали содержание НАДН и ФП. Вместе с тем кинетика ротенон-индуцируемых реакций была быстрее. Он скорее, чем аммиак, изменял окислительно-восстановительное состояние НАДН и ФП, и под его воздействием оно раньше возвращалось к исходному уровню.

Кроме того, реакции обонятельной выстилки на ротенон зависели от степени изменения окислительного метаболизма в обонятельных клетках под влиянием предварительного предъявления им аммиака. Оказалось, что если интенсивность собственной флуоресценции НАДН и ФП при обдувании аммиаком усиливалась (например, на 11% и 6%, соответственно), то ротенон в этой же области обонятельной выстилки вызывал увеличение их свечения всего на 0,5% и 0,6% от исходного уровня. Это означает, что повышение пулов НАДН и ФП, индуцируемое аммиаком, подавляло ротенон-зависимую реакцию.



Аммиак на фоне ротенона в 50% опытов усиливал интенсивность собственной флуоресценции НАДН, а в 25% - ФП. Однако эти изменения их окислительно-восстановительного состояния были меньше, чем ротенон-стимулируемые в том же участке ольфакторного эпителия. Так, например, если под влиянием ротенона уровень свечения восстановленных пиридиннуклеотидов повышался на 8%, а ФП – на 6%, то NH3 на фоне ротенона вызывал усиление собственной флуоресценции НАДН только на 3%, а флавопротеидов – на 2%.

Эти факты, очевидно, говорят о том, что ротенон и аммиак конкурируют за влияние на окислительный метаболизм. Полученный результат, по-видимому, может свидетельствовать о сходном механизме их действия на митохондрии.

Таким образом, из полученных данных следует, что аммиак способен непосредственно воздействовать на окислительно-восстановительное состояние электрон-транспортной цепи митохондрий обонятельных клеток.

3.2.7. Исследование влияния сероводорода на активность
дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток

Под влиянием H2S (n=14) в 58% предъявлений сероводорода синее свечение на протяжении длительного времени увеличивалось менее чем на 1%, а в 43% опытов одорант-индуцируемых изменений интенсивности собственной флуоресценции НАДН не наблюдали (рис. 66 а). Это означает, что сероводорд вызывал небольшое увеличение пула восстановленных пиридиннуклеотидов или вовсе не изменял их окислительно-восстановительного состояния в митохондриях обонятельных клеток.

В 28% случаев обдувание обонятельной выстилки H2S за 133 с усиливало интенсивность желто-зеленой флуоресценции в среднем на 3%, а в 64% предъявлений одоранта она не изменялась по сравнению с исходным уровнем (рис. 66 б). Следовательно, сероводород чаще не вызывал изменения собственной флуоресценции ФП, а если и повышал её, то не более, чем на 3%. Полученные данные свидетельствуют, что бета-меркаптоэтанол, имеющий гнилостный запах, или не приводил к одорант-зависимому окислению ФП, или индуцировал небольшое повышение пула окисленных флавопротеидов в митохондриях обонятельных клеток.

Как видно из представленных данных, реакция дыхательной цепи митохондрий на сероводород отличалась как от реакций на стимуляцию одорантов первой группы, так и на воздействие аммиака. Этот факт свидетельствует, по-видимому, о разных механизмах действия сероводорода на окислительно-восстановительное состояние дыхательной цепи митохондрий по сравнению не только с одорантами первой группы, но и аммиаком.

Чтобы исследовать механизм действия сероводорода на митохондрии мы апплицировали на обонятельную выстилку NaN3 и регистрировали реакцию на его воздействие. Затем анализировали реакцию обонятельной выстилки на сероводород на его фоне.

Результаты исследований показали, что NaN3 (n=6) в 67% случаев инициировал усиление собственной флуоресценции НАДН, которое через 120 с увеличивалось на 5,1%, а в течение более 195 с возвращалось к исходному уровню (рис. 67 а). Увеличение интенсивности синего свечения обусловливалось повышением содержания восстановленных пиридиннуклеотидов в митохондриях, причем, степень NaN3-зависимого восстановления НАД+ почти в 5 раз превышала таковую при стимуляции одорантом. Кроме того, в отличие от сероводорода, митохондрии в подавляющем большинстве случаев реагировали на азид натрия. Полученные данные позволяют заключить, что реакция рецепторных клеток на азид натрия и сероводород сходна: оба вещества восстанавливают пиридиннуклеотиды, но в разной степени. Однако их различия указывают на разницу в механизме действия H2S и NaN3 на редокс-состояние никотинамидадениндинуклеотида в митохондриях обонятельных клеток.

В 50% опытов NaN3 инициировал усиление собственной флуоресценции флавопртеидов в среднем на 2%, в другой половине экспериментов желто-зеленое свечение снижалось в среднем на 1,7% от исходного уровня. Максимального значения реакция достигала в течение 207 с и длилась более 195 с. Это означает, что азид натрия приводил как к окислению, так и восстановлению ФП.

Исходя из проведенных наблюдений, можно заключить, что NaN3 изменял окислительно-восстановительное состояние НАДН и ФП подобно сероводороду. Однако отсутствие резкого подавления окислительного метаболизма, вызываемого азидом натрия по сравнению с H2S, очевидно, говорит о том, что механизм их действия имеет как сходства, так и различия.

Стимуляция обонятельной выстилки одорантом на фоне азида натрия в половине опытов на 1% усиливала собственную флуоресценцию НАДН и на 1,5% - ФП, а в другой половине их не изменяла (рис. 68). Реакция НАДН за 165 с, а ФП за 135 с достигали максимального значения, возвращаясь к исходному уровню в течение 60 с и 80 с, соответственно, и дольше.

Приведенные данные по исследованию влияния аммиака и сероводорода на клеточное дыхание обонятельных клеток показывают, что одоранты с острым и гнилостным запахами обладают некоторым сходством с ингибиторами, непосредственно взаимодействующими с митохондриальной электронтранспротной цепью. Этот факт дает основание считать, что NH3 и H2S способны оказывать прямое действие на окислительно-восстановительное состояние НАДН и ФП.







Сейчас читают про: