Количественное обнаружение

В зависимости от концентрации которую орентировочно считают после снятия спектра в УФ, отбирают аликвоту этанолового элюата (V₄) и переносят в стеклянный бюкс. Этанол удаляют под током теплого воздуха, сухой остаток растворяют в 0,2-0,5 мл этанола и добавляют до 3 мл 2н раствора соляной кислоты. Далее последовательно-0,5 мл 0,5% раствора сульфамата аммония. После добавления каждого реагента раствор интенсивно взбалтывают. Азокраситель сиреневого цвета образуется через 15 минут после добавления 1 мл 0,1% раствора N- L-нафтилэтилендиаминдихлорида. Окраска устойчива в течение суток.

Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре при 500 нм в кювете толщенной поглощающего слоя 1 см. Концентрацию в органах определяют по формуле:

Х= А •(V₁)• (V₃)•1000•4 / Е^1%_1см •V • 100 • V₄ ; где

Х- количество выделенного соединения в мг на 100 г органа;

А- оптическая плотность измеряемого раствора;

Е^1%_{1см -} удельный показатель поглощения (220)

Другие буквенные обозначения указаны в тексте.

Определение удельного показателя поглощения.

В три мерные калибровочные пробирки (для трех повторных определений) на 5 мл вносят по 0,1 мл (100мкг) стандартного спиртового раствора препарата (1мг/мл), добавляют по 3 мл 2н раствора соляной кислоты и гидролизуют в течение 30 минут на глицериновой бане при 125-135°С с обратным холодильником. По окончании гидролиза холодильник промывают 1 мл 2н раствора соляной кислоты и после охлождения гидролизата доводят последний до 5 мл.

Из каждого гидролизата в мерные пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,5% 0,75; 1 мл (2,5, 10, 15, 10 мкг вещества), доводят 2 н раствором соляной кислоты до 3 мл и проводят реакцию образования азокрасителя как указано выше. После определения плотности окрашенного раствора при 550 нм удельный показатель поглощения вычисляют по формуле;

Е^1%_1см = А/ С•L; где

А-оптическая плотность раствора;

С-концентрация раствора в весовых процентах;

L-толщина поглощающего слоя в см.

В качестве раствора сравнения используют смесь реактивов. Подчинение закону Бугера наблюдается в пределах концентраций 5+ 20 мкг в исследуемой пробе (определение содержание по бензофенону, основанное на получении азокрасителя с бета-нафтолом, проводить нельзя ввиду отсутствия характерного спектра поглощения).

Исследование по нативному соединению с метаболитами.