Хроматографическая очисткаи предварительноле обнаружение аконитина

Остаток растворяют в 3 мл хлороформа и переносят 1,0 и 2,0 мл раствора в две фарфоровые чашечки. После концентрирования растворы количественно наносят на стартовую линию тонкого фиксированного слоя силикагеля КСК,забуферённого 0,1н раствором едкого натра, в виде двух полос 1-1,5 см и 2-3 см, соответствующих 1/3 и 2/3 извлечения, хроматографируют в системе этанол-хлороформ 1:5. Метчики-хлороформные растворы аконитина основания, бензоилаконина и аконина, по 0,02мл которых наносят в одну точку на стартовую линию. Длина пробега фронта растворителя 10 см, продолжительность хроматографирования 46-60 мин. Хроматограмму высушивают на воздухе. Зоны метчика и первой полосы, соответствующей 1/3 исследуемого извлечения, опрыскивают модифицированным реактивом йодида висмута в йодиде калия. При наличии аконитона наблюдается пятно жёлто-оранжевого цвета с Rf 0,68-0,75, параллельного метчику. Открываемый минимум 0,5 мкг аконитина основания в пятне.

При наличии бензоилаконина и аконина проявляются пятна, имеющие Rf соответственно 0,20-0,25 и 0,05-0,10.

При отсутствии на хроматограмме пятна с Rf 0,68-0,75, параллельного пятну аконитина, дают заключение о необнаружении аконитина.

Описанной методикой обнаруживаются 50 мкг аконитина, добавленные к 100 г печени.

Непроявленный участок силикагеля, параллельный проявленным пятнам аконитина и соответствующий 2/3 извлечения, переносят с помощью электроотсасывателя в хроматографическую колонку (20х0,8 см), снабжённую капиллярной насадкой. Элюируют аконитин 10 мл ацетона со скоростью не более 60 капель в мин.

Если при проявлении аконитина было получено слабоокрашенное пятно, то его обрабатывают несколькими каплями 10% спиртового раствора едкого кали и высушивают на воздухе. Обесцвеченный участок силикагеля переносят в хроматографическую колонку и элюируют ацетоном при тех же условиях. Элюаты объединяют и выпаривают при 40⁰ досуха.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКОНИТИНА

Остаток растворяют в 10 мл ацетатного буфера (рН4,5) порциями по 4, 3, 3 мл. Раствор переносят в делительную воронку, прибавляют 0,5 мл раствора метилового оранжевого,10 мл хлороформа и энергично встряхивают в течение 2-х мин. После отстаивания хлороформный слой, окрашенный в жёлтый цвет, сливают в калиброванную пробирку, добавляют хлороформ до 10 мл и перемешивают. Оптическую плотность раствора замеряют на спектрофотометре при 420 нм в 1 см кювете или на фотоэлектрокалориметре, используя светофильтр с максимумом светопропускания при 410-430 нм. Раствор сравнения - хлороформ.

Если оптическая плотность анализируемого раствора превышает оптическую плотность стандартного раствора, содержащего 100 мкг аконитина в пробе, исследуемый раствор разбавляют хлороформом в различных соотношениях (до 1:10). Степень разбавления учитывают при расчёте. Концентрацию аконитина определяют по калибровочному графику.

Для построения графика определённые объёмы (от 0,1 до 1,0 мл) стандартного раствора аконитина основания помещают в делительные воронки; объём доводят до 10 мл ацетатным буферным раствором и далее исследуют, как описано выше.

Количественное содержание аконитина рассчитывают по формуле:

Х= 3 ∙ С ∙ V₂ ∙ 100 / 2 ∙ н ∙ V₁ ∙ 1000, где

Х- количество аконитина в 100 г объекта в мг;

С- количество аконитина в 10 мл колориметрируемого раствора, найденное по калибровочному графику в мг;

V₂ / V₁- разведение окрашенного раствора;

Н- навеска объекта в граммах.

Примечание: Если для анализа было взято извлечение, то коэффициент 3/2 следует опустить.

Граница определения – 50 мкг аконитина в 100 г печени.

КАЧЕСТВЕННОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ АКОНИТИНА

После количественного определения окрашенный хлороформный раствор выпаривают в фарфоровой чашечке до 0,5 мл и переносят в хроматографическую колонку, содержащую 0,5 г окиси алюминия II степени активности. После впитывания раствора слоем сорбента через колонку пропускают 5 мл ацетона со скоростью не более 60 капель в минуту. При этом метиловый оранжевый сорбируется на окиси алюминия, а аконитин элюируется ацетоном. Ацетоновый раствор выпаривают при 40⁰ , остаток растворяют в 10 мл 0,1н. раствора соляной кислоты и снимают спектр абсорбции в области 220 - 280нм – максимум поглощения наблюдается при 233 – 234 нм. Раствор сравнения – 0,1н. раствор соляной кислоты. Открываемый минимум – 2 мкг аконитина основания в 1 мл раствора.

Граница обнаружения аконитина спектрофотометрическим методом – 250мкг в 100 г объекта.

Исследуемый солянокислый раствор подщелачивают 25% раствором аммиака до рН 9,0 и экстрагируют хлороформом (5 мл х 2). Хлороформные извлечения фильтруют через небольшой слой натрия сульфата в фарфоровую чашечку и выпаривают при 40⁰ досуха. Остаток растворяют в 2-3 каплях 0,1 н. раствора соляной кислоты и раствор переносят на два предметных стекла с углублениями. К раствору на одном стекле прибавляют каплю 10% раствора аммония (калия) бихромата в 2н. растворе соляной кислоты. Через 5-15 мин. под микроскопом наблюдаются сростки из призматических кристаллов в виде пучков, веток и отдельные призматические кристаллы. Кристаллыаниэотропные, угол погасания прямой, знак удлинения отрицательный. Показатели преломления: n_q =1.618.

n_p =1.609; двупреломление: n_q - n_p =0,009. Открываемый минимум – 0,17 мкг аконитина основания.

Граница обнаружения 100мкг аконитина в 100г печени, при условии деления остатка на две части.

К раствору на втором стекле прибавляют каплю раствора роданидного комплекса никеля. Предметное стекло переносят в чашку Петри, насыщенную парами йода. Через 10-30 минут под микроскопом наблюдают пучки и ветки из призматических кристаллов.

Граница обнаружения – 250 мкг аконитина в 100 г. печени.

Если при количественном определении найдено менее 100 мкг аконитина, то проводят одну реакцию с раствором аммония (калия). Положительный результат данной реакции в сочетании с величиной Rf аконитина на хроматограмме могут служить основанием для заключения об обнаружении аконитина.

При обнаружении на хроматограмме пятна с Rf 020, - 0,25 (бензоилаконин) непроявленный участок силикагеля, соответствующий этому пятну, переносят в колонку и бензилаконин элюируют ацетоном также, как аконитин. После испарения ацетона остаток растворяют в 10 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты и снимают спектр абсорбции в диапазоне 220 – 280 нм (раствор сравнения – 0,1 н. соляная кислота). Обнаружение бензоилаконина по величине Rf на хроматограмме и максимуму абсорбции при 233 – 234 нм может служить дополнительным (наряду с обнаружением аконитина) тестом для доказательства отравлений аконитином.