2015-06-14
4097
использованы: материалы издания Всемирной организации здравоохранения «Basic analytical toxicology» Женева 1997 год., Крамаренко В. Ф. Химико-токсикологический анализ.— К: Вища шк. Головное изд-во, 1982 г.
1. ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время ядохимикаты широко используются в сельском хозяйстве, в быту, как эффективные средства борьбы с вредителями и болезнями растений, как средства защиты животных. Ядохимикаты также применяются для борьбы с грызунами - переносчиками заразных болезней. Применяемые ядохимикаты принадлежат к различным классам химических соединений. Все они объединяются под общим названием пестициды. Эти вещества могут оказать вредное действие на организм человека. Наличие отдельных случаев отравлений ядохимикатами свидетельствует об их токсичности, вследствие чего они могут быть объектами как химико-токсикологического анализа (ХТА), так и судебно-химического анализа (СХА).
Согласно приказу № 875/1 от 20.12.2004 года в перечень веществ, подлежащих обязательному химико-токсикологическому исследованию входят следующие пестициды (фосфорорганические соединения) ФОС – это эфиры, амиды или тиоловые производные фосфорной, фосфористой или пирофосфорной кислот.
Общий список - карбофос, метафос, хлорофос, дихлорофос, метилнитрофос, фталофос, фозалон, бутифос, севин, октаметил. (исследование на октаметил описано в отдельной методике)
Принцип метода. Метод основан на извлечении ФОП, очистке экстрактов от мешающих анализу соэкстрактивных веществ путем перераспределения в несмешивающихся растворителях и колоночной адсорбции, концентрировании экстрактов и хроматографировании в тонком слое силикагеля в системе растворителей. Процент определения составляет 85±15.
2. Схема анализа
Общая схема анализа ядохимикатов состоит из трех этапов:
-Извлечение (экстракция препарата из исследуемой пробы);
-Очистка экстракта;
-Качественное обнаружение;
-Количественное определение;
2.1.Извлечение (экстракция препарата из исследуемой пробы).
Существует несколько методик изолирования искомых фосфорорганических препаратов, в зависимости от наименования препарата.
2.1.1. Изолирование из подкисленной воды (карбофоса, метафоса). В колбу вместимостью 500 мл вносят 100 г измельченного биологического материала и 150 мл воды, подкисленной серной кислотой до рН = 2,0-2,5. Смесь оставляют на 2 ч, часто перемешивая, затем процеживают через марлю. К биоматериалу еще два раза прибавляют воду, подкисленную до рН = 2,0-2,5 (по 75 мл) и каждый раз настаивают по 1 ч, а затем сливают водные вытяжки. Объединенные кислые водные вытяжки центрифугируют. Центрифугат переносят в делительную воронку, прибавляют 30 мл хлороформа и смесь взбалтывают 10 мин. Хлороформную вытяжку сливают. Далее еще 4 раза экстрагируют хлороформом (по 30 мл) из кислой водной вытяжки. Хлороформные вытяжки соединяют и выпаривают при комнатной температуре досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл воды, затем раствор фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат используют для обнаружения фосфорорганических препаратов.
2.1.2. Изолирование органическими растворителями. (хлорофос). В колбу вместимостью 500 мл вносят 100 г мелкоизмельченного биологического материала, прибавляют воду до получения кащицеобразной массы и 100 мл хлороформа. Содержимое колбы оставляют на 4 ч при частом взбалтывании. Затем отделяют хлороформную вытяжку, а биологический материал еще 2 раза настаивают с хлороформом (порциями по 50 мл) в течение 2 ч при частом взбалтывании. Хлороформные вытяжки соединяют, фильтруют и выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл хлороформа. В полученном растворе определяют наличие фосфорорганических препаратов.
2.1.3. Методика изолирования бутифоса. Пробу массой 20 г заливают 10 мл дистиллированной воды и гомогенизируют в микроизмельчителе 1—2 мин при 1000 об/мин. Гомогенат заливают 20 мл ацетона, оставляют на час при комнатной температуре и центрифугируют 20 мин при 8 тыс. об/мин. Водно-ацетоновый слой отфильтровывают через смоченный хлороформом бумажный фильтр в делительную воронку, добавляют 3 мл насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают, приливают 50 мл хлороформа и снова перемешивают легким покачиванием воронки. После расслоения нижний ацетоно-хлороформный слой сливают и фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу или химический стакан вместимостью 150 мл. Затем в делительную воронку вносят еще 50 мл хлороформа и снова сливают и фильтруют нижний ацетоно-хлороформный слой. Слитые нижние слои объединяют. В экстракт вносят 10 г безводного сульфата натрия, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу на 50 мл. Фильтры промывают 5 мл хлороформа и доводят им до метки. В полученном экстракте определяют наличие фосфорорганических препаратов
2.1.4. Изолирование диэтиловым эфиром. (Общая методика для всех ФОП списка при не направленном анализе). 25,0г ткани органа измельчают, прибавляют 25,0г безводного сульфата натрия до получения кашицы и трижды экстрагируют диэтиловым эфиром по 50х50х25 мл, настаивая каждый раз по часу. Эфирные извлечения объединяют, фильтруют и выпаривают при комнатной температуре. Сухие остатки количественно переносят 4 раза по 15 мл 50% спиртом в делительную воронку и трижды по 15 мл экстрагируют хлороформом по 10 мин. Центрифугаты фильтруют через бумажные фильтры с безводным сульфатом натрия в мерную колбу на 50 мл. Фильтры промывают 5 мл хлороформа и доводят им до метки. В полученном экстракте определяют наличие фософорорганических соединений.
2.2 ТСХ - анализ фосфорорганических пестицидов (ФОС).
В анализе ядохимикатов тонкослойная хроматография может использоваться для разделения, идентификации и количественного определения (визуальная оценка) пестицидов и их метаболитов, а также для очистки их от экстрактивных веществ. При исследовании в основном используют восходящую одномерную хроматографию. ТСХ - анализ ядохимикатов состоит из следующих этапов: нанесение пробы и стандартных веществ на пластинку; разделение в камере с подвижной фазой; высушивание пластинки; проявление разделенных компонентов; расчет величин удерживания(Rf);идентификация веществ.
Чувствительность метода на силикагеле 0,5 мг/кг, а на пластинках «Силуфол» («Сорбфил»)—0,1 мг/л.
Хроматографические пластины:
Самодельные: а) на силикагеле КСК; б) реже - оксид алюминия;
Заводские: «Силуфол», «Армсорб», «Сорбфил».
Качественное обнаружение может осуществляться путем:
1. Установление элементарного состава – определение фосфора, серы, галогена;
2. Определение функциональных групп;
3.Определение индивидуальной природы вещества по целой молекуле
Подвижные фазы: Общие: 1)хлороформ слегка насыщенный водой; 2)гексан-ацетон (4:1); 3)хлороформ-ацетон(9:1).
2.2.1. Детектирование ФОС.
I. Общими детектирующим реагентом для всех ФОС являются:
1.раствор хлорной и соляной кислот в присутствии молибдата аммония (95 мл 1% молибдата аммония в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты + 5 мл 57% раствора хлорной кислоты) с последующим нагреванием пластинки в сушильном шкафу 1 час при температуре 2000С. По охлаждении пластинку помещают в УФ-свет на 30 мин на расстоянии 15 мин от источника света, после чего проявляют смесью растворов А и Б (А - раствор 2,0г бриллиантового зеленого в 350 мл воды), Б – 4 г молибдата аммония растворяют в 45 мл дистиллированной воды при нагревании, охлаждают, добавляют 50мл 10 н. раствора хлористоводородной кислоты, объем доводят водой до 100мл), и накрывают покровным стеклом. При наличии ФОС наблюдают пятна зеленого цвета на желтом или оранжевом фоне.
2. 0,5% раствор бриллиантового зеленого в ацетоне. После обработки пластинку подсушивают и помещают в пары брома. При наличии ФОС – желтые пятна на зеленом фоне.
3.свежеприготовленный аммиачно-ацетоновый раствор нитрата серебра(0,5г нитрата серебра, 5мл воды очищенной, 7мл 25% раствора гидроксида аммония и ацетон до 100мл), с последующей экспозицией пластинки под УФ-светом в течение 30 мин на расстоянии 15 см от источника света. ФОС проявляются в виде пятен темно-серого цвета на белом фоне.
II. Для ФОС содержащих в своем составе атом S (карбофос, метафос, фозалон, метилнитрофос, фталофос, бутифос):
Свежеприготовленный раствор бромфенолового проявителя. (0,05 г бромфенолового синего растворяют в 10 мл ацетона. К 1 мл раствора прибавляют 9 мл 0,5 % раствора нитрата серебра в смеси вода-ацетон (1:3).После обработки эти раствором пластинку нагревают при 50о С в течение 10 минут, затем охлаждают. Для осветления фона используют 5% раствор уксусной кислоты или 2% раствор лимонной кислоты.
2,6-дибром –N- хлорхинонимин (в виде 0,5% раствора в гексане), с последующим термостатированием при 1050-1100С. Наблюдаются красные, оранжевые пятна на сером фоне.
Обнаружение палладиевым реактивом. (0,2г хлорида палладия в в 40-50мл 0,01н-0,1н хлористоводородной кислоты). Аналитический эффект наблюдают в течение 24часов.
III. Для ФОС, содержащих в своем составе атом галогена (хлорофос, дихлорофос, фозалон):
Раствор серебра нитрата с 2-феноксиэтанолом (0,25г серебра нитрата, 2,5мл воды очищенной, 5мл 2-феноксиэтанола и ацетон до 100мл. для увеличения проявляющей способности +2-3капли перекиси водорода) с последующей экспозицией пластинки в УФ-свете в течение 30 мин на расстоянии 15 см от источника света. ФОС проявляются в виде пятен темно-серого цвета на белом фоне.
2. 0,5% раствор о-толидина в этаноле. При наличии ФОС – оранжевые пятна на желтом фоне.
Специфическим детектирующим реагентом является: 1% раствор резорцина в 10% растворе едкого натра. Сверху пластинку покрывают чистой стеклянной пластинкой. При положительном результате через 5-20 минут наблюдаются красные пятна с Rf= 0,20(хлорофос) и Rf= 0,50(ДДВФ)
IV. Для ФОС, содержащих в своем составе нитрогруппу (метафос, метилнитрофос):
10% раствором гидроксида натрия с последующей экспозицией в сушильном шкафу при 1000 С на 5 мин. При наличии ФОС - наблюдаются пятна лимонно-желтого цвета.
Восстановление нитрогруппы до аминогруппы с последующим проведением реакции диазотирование и сочетания с l –нафтолом.
Частными подвижными фазами для ТСХ-анализа хлорофоса и дихлорофоса являются: а) гексан: ацетон (1:1) и (2:1) соответственно; б) хлороформ:эфир: вазелиновое масло(17:2:1).
Частными подвижными фазами для тсх-анализа карбофоса являются: а) гексан: ацетон(9:1); б) гексан: этиловый эфир (10:2); в) этиловый эфир: петролейный эфир (1:2).
Частными подвижными фазами для метафоса являются: а) гексан: ацетон(9:1); б)гексан-хлороформ (1:2). Rf = 0,30-0,36; в) последовательное хроматографироание в системах – гексан-ацетон(4:1), гексан-эфир(1:1) и гексан:ацетон(1:1). Rf = 0,87.
Частной подвижной фазой для фозалона, фталофоса является – хлороформ. Rf = 0,45-0,50 (фталофоса) и Rf = 0,65-0,72(фозалона);
Частной подвижной фазой для бутифоса является – гексан: ацетон(4:1). Rf = 0,45-0,50.
Определение хлорофоса в хроматографией в тонком слое.
Принцип метода. Метод основан на извлечении препарата из пробы водой, последующем извлечении из воды органическим растворителем, хроматографировании в тонком слое силикагеля и дополнительной очистке на пластинках. Подвижным растворителем служит смесь гексана с ацетоном (1:1). Препарат обнаруживают после опрыскивания пластинок раствором резорцина с карбонатом натрия и выдерживания при 100°С или после опрыскивания пластинок раствором азотнокислого серебра и аммиака в ацетоне и последующего ультрафиолетового облучения. Количественно определение проводят путем визуального сравнения интенсивности окраски и размеров пятен проб и стандартных растворов. Чувствительность метода 0,1—0,2 мг/кг. Минимально детектируемое количество 1 мкг.
Реактивы и растворы. Хлороформ х. ч. перегнанный. Ацетон х. ч. н-Гексан
х. ч. Диэтиловый эфир (для наркоза). Бензол х. ч. Силикагель КСК или ШСК очищенный. Очистку проводят следующим образом: заливают силикагель на 18—20 ч разбавленной соляной кислотой (1:1), кислоту сливают, силикагель промывают водой и кипятят с разбавленной (1:1) азотной кислотой 2—3 ч в колбе с обратным холодильником. Промывают силикагель дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, сушат 6 ч в сушильном шкафу при 130ºС, периодически перемешивая. Дробят и просеивают через сито 100 меш. (1600 отверстий на 1 см2).
Хранят в склянке с притертой пробкой.
Крахмал растворимый. Натрий сернокислый безводный (х.ч.) Серебро азотнокислое (х. ч.). Резорцин (х. ч.). Карбонат натрия (х. ч.). Соляная кислота, уксусная и ортофосфорная кислоты.
Проявляющий реактив № 1: 2%-ный раствор резорцина и 10%-ный водный
раствор Nа2СОз. Перед опрыскиванием растворы смешивают (2:3).
Проявляющий реактив № 2: 0,5 г азотнокислого серебра растворяют в 5 мл дистиллированной воды, прибавляют 10 мл аммиака плотностью 0,9 г/см3 и доводят объем до 100 мл ацетоном.
Стандартный раствор хлорофоса (10 мг хлорофоса в 100 мл диэтилового эфи-
ра).
Приборы и посуда. Пластинки для хроматографии 9х12 или 13х18 см или «Силуфол» ЧССР, «Сорбфил». Делительные воронки на 500 и 250 мл. Мерные колбы на 100 мл. Конические колбы на 250 и 500 мл с притертыми пробками. Прибор для отгонки растворителя под вакуумом. Водоструйный насос или воздуходувка. Пульверизатор стеклянный для опрыскивания пластинок. Камера для хроматографирования. Стеклянный сосуд с притертой крышкой. Можно использовать эксикатор. Микропипетки для нанесения стандартных растворов. Капиллярные пипетки для нанесения проб.
Бани водяные. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4, ОЛД. Сушильный шкаф.
Приготовление пластинок. Сорбционную массу готовят из силикагеля КСК
или ШСК (40 г), крахмала (1 г) и дистиллированной воды (125 мл). Крахмал заваривают в 15 мл воды, доливают остальную воду, засыпают силикагель и хорошо перемешивают.
10 г сорбционной массы наливают на пластинку и, покачивая ее, равномерно
распределяют массу. Пластинки сушат при комнатной температуре, хранят в эксикаторе.
Ход анализа. Для анализа из средней пробы отбирают: 100 мл крови, 250 г тканей органов, мочи 200 мл. Ткани органов измельчают и тщательно перемешивают.
Моча. 200 мл мочи в делительной воронке трижды экстрагируют насыщенным водой хлороформом порциями 70, 70 и 50 мл Каждая экстракция продолжается 5 мин. В объединенный экстракт насыпают около 10 г безводного сернокислого натрия. Оставляют экстракт на 10—15 мин для удаления влаги.
Кровь. К 25 мл крови в конической колбе добавляют по каплям 0,5 мл кон-центрированной соляной, уксусной или ортофосфорной кислоты, 50 мл серного эфира и небольшими порциями 20 г свежепрокаленного безводного сульфата натрия. Полученную смесь энергично встряхивают 10 мин. Эфирный экстракт сливают по частям в коническую колбу на 50 мл, удаляют эфир на водяной бане при 40—45ºС до объема 1 мл, а затем остаток испаряют при комнатной температуре. К оставшемуся в колбе жиру добавляют 3 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы взбалтывают 1—2 мин при подогревании на водяной бане или под струей теплой воды. Смесь охлаждают холодной водой, затем в холодильнике до затвердевания жира. Водный экстракт хлорофоса через смоченный водой бумажный фильтр в маленькой конической воронке фильтруют в делительную воронку вместимостью 50 мл. Операцию повторяют дважды, внося в колбу с жировым остатком по 2 мл воды. Водный экстракт хлорофоса в делительной воронке промывают н-гексаном 3 раза порциями по 10 мл. Гексановые экстракты отбрасывают. Очищенный водный экстракт трижды экстрагируют насыщенным водой хлороформом порциями по 15 мл, встряхивая в делительной воронке каждый раз 5 мин. Объединенные хлороформные экстракты сушат 10—15 мин безводным сернокислым натрием и переносят в мерную колбу.
Ткани органов. 25 г измельченного биологического материала дважды экстрагируют по 30 мин дистиллированной водой порциями по 70 мл, периодически перемешивая. Водные экстракты объединяют, прибавляют 1—1,5 г хлористого натрия, хлорофос экстрагируют насыщенным водой хлороформом порциями по 50, 40 и 40 мл. При встряхивании в делительной воронке в нижнем хлороформном слое образуется стойкая эмульсия. Экстракты объединяют и для разрушения эмульсии постепенно прибавляют безводный сернокислый натрий, помешивание не прекращают до исчезновения эмульсии. Колбу с содержимым оставляют на 10—15 мин, затем хлороформ сливают через слой безводного сернокислого натрия в сухую колбу. Колбу с оставшимся сернокислым натрием промывают хлороформом 4 раза по 15 мл и приливают его к экстракту.
Отгонка растворителя. Обезвоженный хлороформный экстракт отгоняют на водяной бане при температуре не выше 40°С до объема около 0,3 мл при разрежении от водоструйного насоса. Оставшийся экстракт количественно переносят в мерную колбу, упаривают при комнатной температуре досуха, пробу растворяют в диэтиловом эфире.
Хроматографирование. Пластинку с пробами и стандартными растворами помещают в камеру для хроматографирования, в которую предварительно наливают бензол (для дополнительной очистки пробы на пластинке). Край пластинки с нанесенными растворами должен быть погружен в растворитель не более чем на 0,5 см. После того как фронт растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут для испарения растворителя Пластинку вновь помещают в камеру для хроматографирования с подвижным растворителем (смесь гексана с ацетоном 1:1) и хроматографируют, как указано выше. Высушенную пластинку опрыскивают проявляющим реактивом.
Для проб применяют реактив № 1. После опрыскивания проявителем пластинку выдерживают 7—10 мин при 100ºС. Хлорофос проявляется в виде оранжевого пятна с Rf 0,31.
Для подтверждения исследуются дополнительные пробы реактивом № 2. После опрыскивания реактивом пластинку подвергают ультрафиолетовому облучению в течение 40 мин. Пластинка должна находиться на расстоянии 20 см от источника света. Хлорофос проявляется в виде серо-черного пятна.
Продукт метаболизма хлорофоса (ДДВФ) определению хлорофоса не мешает, потому что его Rf в этих условиях равно 0,56.
Количественное определение проводят путем сравнения размеров пятен про-
бы и стандартного раствора. Необходимо отметить, что количественное определение с достаточной точностью можно проводить лишь при содержании пестицида не более 30 мкг в пробе. При большем содержании препарата зоны локализации получаются размытыми, что затрудняет сравнение со стандартом. В этом случае нужно брать пропорциональную часть исследуемого экстракта.
Расчет. Содержание препарата в пробе (мг/кг) вычисляют по формуле
Х = А/Р
где А — количество препарата, найденное путем сравнения со стандартом,
мкг; Р — масса исследуемой пробы, г.
Метафос
Химически чистый метафос — 0,0-диметил-0-4-нитрофенилтиофосфат. Белое
кристаллическое вещество с температурой плавления 35—36°С. Относительная молекулярная масса 263,22. Растворимость в воде при 25°С около 55 мг/л. Метафос плохо растворяется в парафиновых углеводородах, но хорошо растворяется в ароматических углеводородах и большинстве органических растворителей. Препарат гидролизуется водой, кислотами и щелочами, разрушается солнечным светом.
Принцип метода. Метод основан на извлечении метафоса из проб органиче-
ским растворителем, отгонке растворителя, последующем хроматографировании в тонком слое силикагеля КСК или силикагеля КСК с цинковой пылью при использовании в качестве подвижной фазы смеси гексана с ацетоном (4:1).
Зоны локализации препарата определяют после обработки пластинок раство-
ром щелочи или раствором диметиламинобензальдегида (на пластинке силикагель + цинк). Чувствительность метода при обработке первым реактивом 5 мкг метафоса в анализируемой пробе, вторым — 1—3 мкг. Величина Rf метафоса равна 0,38±0,02.
Количественное определение метафоса проводят путем сравнения интенсивности окраски и размеров пятен препарата пробы и стандартов раствора. Полнота определения 85%.
Реактивы и растворы. Ацетон х. ч. или ч. д. а. н-Гексан х. ч. 0,25%-ный рас-
твор п-диметиламинобензальдегида в этаноле. Хранят в темной склянке. Раствор перед обработкой пластинок смешивают в соотношении 10:1 с ледяной уксусной кислотой. Кальций сернокислый (CaSO4·2H2O), высушенный при 160°С в течение 6 ч и просеянный через сито (100 меш.). Хранят без доступа влаги. 4 н. водный раствор натра едкого. Натрий сернокислый безводный. Силикагель КСК. Продажный силикагель измельчают и просеивают через сито 100 меш. Хранят без доступа влаги.
Стандартный раствор метафоса в н-гексане (100 мкг/мл). Уксусная кислота ледяная. Цинковая пыль. Хлороформ х. ч. или ч. д. а. Спирт этиловый ректификат. Эфир диэтиловый перегнанный.
Приборы и посуда. Аппарат для встряхивания. Делительные воронки вме-стимостью 250 мл. Капиллярные пипетки. Колбы конические вместимостью 200 мл. Колбы мерные. Микропипетки. Прибор для отгонки растворителей с набором колб. Цилиндры мерные. Пульверизатор. Хроматографическая камера.
Приготовление пластинок. 14 г силикагеля тщательно смешивают в ступке с 1,5 г сернокислого кальция. Смесь суспендируют в 40 мл дистиллированной воды и равномерно наносят на 7— 8 пластинок 9х12 см (примерно 6 мл суспензии на пластинку). Для приготовления пластинок с цинковой пылью к указанному количеству силикагеля и сернокислого кальция прибавляют 1 г просеянной цинковой пыли.
Пластинки сушат на воздухе при комнатной температуре 17—18 ч, хранят в эксикаторе над слоем осушителя. Можно использовать пластинки «Силуфол».
Ход анализа.
Моча. 100 мл мочи помещают в делительную воронку и трижды экстрагируют пестицид эфиром порциями по 20 мл, встряхивая каждый раз 2—3 мин. Объединенные экстракты фильтруют через слой безводного сульфата натрия в колбу для отгонки растворителей. Эфир отгоняют на
Внутренние органы. Пробу массой 50 г измельчают, заливают 50 мл н-гексана, экстрагируют 20 мин на аппарате для встряхивания. Экстракцию повторяют дважды. Гексановые экстракты объединяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия в мерную колбу.
Хроматографирование. 1/3 часть экстракта концентрируют в выпарительной чашке и капиллярной пипеткой наносят на пластинку. Стенки чашки еще 3—4 раза ополаскивают небольшими порциями диэтилового эфира (по 0,2 мл), каждый раз наносят раствор в центр первого пятна.
Пластинку с пробами и стандартными растворами помещают в камеру для хроматографирования со смесью гексана с ацетоном (4:1). После подъема фронта растворителя на высоту 10 см хроматографирование прекращают, пластинку помещают в вытяжной шкаф на 5—10 мин для удаления паров растворителей. Затем пластинку опрыскивают 4 н. раствором едкого натра и выдерживают в сушильном шкафу 20 мин при температуре 120—130°С.
Метафос на пластинке проявляется в виде желтых пятен. При использовании
пластинок с цинком слой обрабатывают до влажного состояния смесью п-диметиламинобензальдегида с ледяной уксусной кислотой и выдерживают в сушильном шкафу 5—7 мин при температуре 100—120°С. В этом случае зоны локализации метафоса окрашиваются в ярко-желтый цвет.
Количество метафоса определяют путем сравнения размеров и интенсивности окраски пятен пробы и стандартного раствора.
Расчет. Содержание метафоса в пробе вычисляют по формуле
Х = А/Р
где X — содержание метафоса в пробе, мг/кг или мг/л; А — количество метафоса, найденное путем сравнения со стандартами, мкг; Р — масса или объем анализируемой пробы, г или мл.
Метилнитрофоса.
Принцип метода. Метод основан на извлечении метилнитрофоса и паранит-
рокрезола (продукт гидролиза метилнитрофоса) из патологического материала н-гексаном, а из мочи диэтиловым эфиром и хроматографировании экстрактов в тонком слое окиси алюминия или на силикагелевых пластинках «Силуфол UV-254». Подвижным растворителем служит смесь гексана с ацетоном (2:1). Пятна препаратов обнаруживают путем опрыскивания пластинок раствором едкого натра и нагревания. Образующиеся нитрокрезоляты имеют желтую окраску.
Количественное определение проводят путем сравнения площадей пятен пробы и стандартных растворов с учетом интенсивности окраски пятен. Чувствительность определения метилнитрофоса в тонком слое окиси алюминия 0,1 мг/л в моче. Чувствительность определения паранитрокрезола в 10 раз выше. На пластинках «Силуфол» чувствиельность обнаружения метилнитрофоса и паранитрокрезола в 5 раз выше, чем в тонком слое окиси алюминия, потому что инертный неорганический люминесцентый индикатор и рефлектирующая алюминиевая фольга повышают интенсивность
окраски пятен Хроматографические пластинки «Силуфол UV-254» производства ЧССР (рефлектирующая алюминиевая фольга со слоем силикагеля, содержащего инертный люминесцентный индикатор).
Приготовление пластинок. 50 г окиси алюминия, просеянной через сито 100 меш. и 5 г сернокислого кальция смешивают в фарфоровой ступке, переносят в коническую колбу с притертой пробкой, приливают 75 мл дистиллированной воды и встряхивают 15 мин. 10 г полученной сорбционной массы наносят на пластинку и равномерно распределяют по ее поверхности. Пластинки сушат при комнатной температуре 12 ч и хранят в эксикаторе.
Ход анализа.
Моча. 50 мл мочи экстрагируют трижды диэтиловым эфиром порциями по 30, 20, 10 мл в течение 30, 10, 10 мин соответственно. Экстракты переносят в колбу, сушат безводным сульфатом натрия (10 г) в течение 20—30 мин и фильтруют. Колбу с сульфатом натрия промывают дважды порциями по 10 мл эфира, которые фильтруют через тот же фильтр. Затем растворитель испаряют на воздухе или в вакуумном ротационном испарителе при температуре 40°С. Из колбы испарителя сухой остаток смывают 10 мл эфира, которые переносят в фарфоровую чашку и испаряют на воздухе. Сухой остаток смывают со стенок чашки 2—5 мл растворителя и испаряют досуха.
Внутренние органы. 20 г тканей органов помещают в колбы с притертыми пробками и экстрагируют пестициды трижды н-гексаном порциями по 20, 10 и 10 мл (для пробы 10 г) в течение 30, 10 и 10 мин соответственно при встряхивании. Экстракты фильтруют через фильтр с безводным сульфатом натрия, который затем дважды промывают порциями по 10 мл н-гексана. Растворитель испаряют досуха одним из указанных выше способов.
Хроматографирование. Сухой остаток в фарфоровой чашке растворяют в двух порциях н-гексана по 0,1 мл и наносят на хроматографическую пластинку с тонким слоем окиси алюминия или на пластинку «Силуфол» на расстоянии 1,5 см от края в одну точку так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Пластинку с пробами и стандартными растворами помещают в камеру для хроматографирования, куда за 30 мин до анализа наливают подвижной растворитель — смесь гексана с ацетоном (2:1). Как только фронт растворителя поднимется на 10 см от стартовой линии, пластинку помещают на несколько минут в вытяжной шкаф для испарения растворителя. Пластинку опрыскивают 20%-ным раствором едкого натра. Стеклянные пластинки с тонким слоем окиси алюминия выдерживают в сушильном шкафу 10 мин при 180°С, а пластинки «Силуфол»—5 мин при 100°С.
Если проба содержит метилнитрофос и паранитрокрезол, на пластинке проявляются пятна лимонно-желтого цвета, соответствующие по цвету и значению Rf пятнам стандартных растворов. В тонком слое окиси алюминия Rf паранитрокрезола равно 0,25. Метилнитрофос проявляется в виде двух пятен с Rf 0,55 и 0,42. На пластинках «Силуфол» Rf паранитрокрезола равно 0,53, метилнитрофоса — 0,63 и 0,75.
Расчет. Содержание препарата в пробе рассчитывают по формуле
X= Sx А/ Sst Р
где X — содержание препарата в пробе, мг/кг; Sx — площадь пятна исследуе-
мой пробы, мм2; Sst — площадь пятна стандарта, мм2; А — количество препарата в пробе, найденное путем сравнения со стандартными растворами, мкг; Р — масса пробы, г.
Необходимо заметить, что количественное определение метилнитрофоса и паранитрокрезола с достаточной точностью можно проводить только при содержании пестицидов не более 40 мкг в пробе. При большем содержании пятна получаются на пластинке диффузными, что затрудняет сравнение их со стандартами. В этом случае для анализа следует брать аликвотную часть экстракта.
Определение трихлорметафоса-3 тонкослойной хроматографией
Чистый трихлорметафос – 3-0-метил-0-этил-0-2,4,5,-трихлорфенилтиофосфат. Бесцветная маслянистая жидкость с температурой кипения 127°С при 0,15 мм рт. ст. (летучесть около 8 мг/м3). Трихлорметафос-3 хорошо растворяется в большинстве органических растворителей; растворимость в воде менее 40 мг/л.
Принцип метода. Трихлорметафос-3 (ТХМ-3) извлекают из пробы смесью органических растворителей, экстракт очищают на хроматографической колонке, элюат отгоняют под вакуумом и хроматографируют в тонком слое окиси алюминия.
Подвижным растворителем служит н-гексан. Проявляют с помощью растворов едкого натра и феррицианида калия по реакции с 4-аминоантипирином.
Чувствительность метода 0,5 мкг в пробе.
Реактивы и растворы. Ацетон х. ч. перегнанный. Бензол х. ч. перегнанный.
н-Гексан х. ч. перегнанный или петролейный эфир (tкип 40—70°С) перегнанный.
Окись алюминия для хроматографии, просеянная через сито 150 меш. Гипс
(CaSO4·2H20)., выдержанный 6 ч в сушильном шкафу при 150°С и просеянный через сито 150 меш. 6%-ный раствор едкого натра в смеси метанола и бутанола (1:1). 0,5%-ный водно-ацетоновый раствор феррицианида калия (30 мл дистиллированной воды + 70 мл ацетона). 4-аминоантипирин. Насыщенный раствор натрия хлористого. 5%-ный раствор оксалата калия или насыщенный раствор оксалата натрия.
Приборы и посуда. Воронки делительные вместимостью 250 мл. Хроматографические колонки 18х390 мм. Прибор для вакуумной отгонки растворителей.
Стаканчики химические вместимостью 100 мл. Колбы круглодонные на 250—500 мл со шлифом.
Приготовление пластинок. Окись алюминия для хроматографии I или II степени активности тщательно растирают в фарфоровой ступке с гипсом в соотношении 10:1. 60 г смеси переносят в коническую колбу и добавляют раствор 4-аминоантипирина (0,4 г 4-аминоантипирина на 60 мл дистиллированной воды).
Смесь тщательно размешивают, наносят на пластинки слоем толщиной 0,2—0,3 мм.
После высыхания пластинки ставят в штатив в вертикальном положении, а затем в сушильный шкаф с температурой 110°С на 15 мин. Хранят пластинки в темноте не более трех дней. Можно использовать пластинки «Силуфол».
Ход анализа.
50 мл мочи помещают в делительную воронку на 300 мл, приливают по 5 мл оксалата калия и насыщенного раствора поваренной соли, перемешивают, приливают 100 мл ацетона, встряхивают 2 мин. Приливают 100 мл хлороформа и встряхивают 2 мин. Воронку оставляют до полного расслоения. Верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюю выливают в круглодонную колбу со шлифом, растворитель испаряют досуха. Остаток смывают 30 мл гексана.
Внутренние органы. К 25 г измельченной ткани прибавляют 25 мл насыщенного раствора хлористого натрия, растирают в ступке, полученную кашицеобразную массу выливают в делительную воронку. К смеси приливают 100 мл ацетона, встряхивают 5 мин, затем приливают 150 мл хлороформа, встряхивают 5-10 мин и оставляют до разделения фаз. После разделения фаз нижний слой сливают в круглодонную колбу, растворители отгоняют, а остаток растворяют в 30 мл петролейного эфира.
Очистка экстрактов от примесей. В нижнюю часть хроматографической колонки помещают стекловату, затем насыпают 70 мл силикагеля АСК и уплотняют его постукиванием. Колонку промывают 50 мл петролейного эфира, а затем вводят в нее конечный экстракт. Пестицид элюируют 110 мл смеси бензола с петролейным эфиром (3:8) порциями по 25—30 мл. Элюат собирают в круглодонную колбу вместимостью 250—300 мл. Элюат упаривают до 20—30 мл и переносят в круглодонную колбу с оттянутым донышком. Ополаскивают первую колбу 10 мл гексана и смывы помешают во вторую колбу. Элюат отгоняют до тех пор, пока он не сконцентрируется в оттянутой части колбы.
Хроматографирование. На расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки на
стартовую линию наносят экстракты проб и стандартный раствор трихлорметафоса-3 таким образом, чтобы диаметр пятен не превышал 0,5 см. Стенки колбы ополаскивают 0,2—0,3 мл растворителя, который наносят в центр первого пятна. Пластинку ставят в камеру для хроматографирования и выдерживают до тех пор, пока фронт растворителя не поднимется на высоту 10 см. Пластинку вынимают, просушивают и ставят для повторной разгонки. Как только фронт достигает отмеченной линии, пластинку вынимают из камеры и сушат. Для проявления препарата пластинку слегка опрыскивают 6%-ным раствором едкого натра в смеси метанола с бутанолом и ставят в сушильный шкаф на 5 мин с температурой 80—100ºС. После остывания пла-
стинку 2—3 раза опрыскивают 0,5%-ным раствором феррицианида калия до появления розово-малиновых пятен округлой формы.
Для количественного определения трихлорметафоса-3 выводят калибровочную шкалу путем нанесения на пластинку стандартных растворов трихлорметафоса-3, содержащих 0,2; 0,5; 1; 4; 5 и 10 мкг препарата в 0,1 мл растворителя. Пластинку хроматографируют дважды в гексане и проявляют по описанной выше методике.
Величину Rf полученных пятен сравнивают с величиной Rf пятен пробы. Rf трихлорметафоса-3 равно 0,37.
Расчет. Содержимое препарата вычисляют по формуле
Х = А/Р
где X — содержание препарата в пробе, мг/кг или мг/л; А — количество пре-
парата, найденное в пробе, мкг; Р — масса или объем исследуемой пробы, г или мл.
Фозалон.
Краткая характеристика препарата приведена ранее.
Принцип метода. Метод основан на экстрагировании фозалона из исследуе-
мых проб, очистке экстрактов и хроматографическом разделении в тонком слое на пластинках «Силуфол». Для проявления хроматограмм используют раствор азотнокислого серебра и 2-феноксиэтанола в ацетоне.
Метрологическая характеристика метода. Нижний предел определения
препарата 0,2 мг/кг. Степень определения 75%.
Реактивы и растворы. Ацетон х. ч. Гексан х. ч. Бензол х. ч. Уксусная кисло-
та ледяная. Стандартный раствор фозалона в гексане. Проявляющий реагент: 0,05 г азотнокислого серебра растворяют в 1 мл воды и доводят объем до 100 мл 10%-ным раствором 2-феноксиэтанола в ацетоне.
Приборы и посуда. Пластинки для хроматографии «Силуфол». Склянки с притертой пробкой на 100 мл. Делительные воронки на 250 мл. Цилиндры на 50 мл.
Фарфоровые чашки. Водяная баня. Лампа ПРК-4. Фильтры бумажные. Пробирки с притертой пробкой, градуированные на 1 мл. Микропипетки на 0,1 мл. Пипетки на 5 мл. Пульверизатор стеклянный. Камера для хроматографирования. Фен.
Подготовка к определению. Ткани внутренних органов тщательно измельчают.
Ход определения.
Экстракция и очистка экстрактов. Пробу 30 г измельченной ткани помещают в склянку с притертой пробкой, заливают 90 мл ацетона, размешивают стеклянной палочкой и помещают в холодильник на 1 ч, через каждые 15 мин склянку встряхивают. Затем сливают через тройной слой марли в делительную воронку. Склянку ополаскивают 10 мл ацетона. Смыв сливают в ту же делительную воронку, после чего в делительную воронку с экстрактом наливают 40 мл дистиллированной воды, воронку встряхивают, добавляют в нее 40 мл гексана, еще раз встряхивают в течение 2 мин. После разделения верхний гексановый слой декантируют в мерную колбу.
Аликвоту экстракта помещают в выпарительную чашку и концентрируют.
Определение фозалона тонкослойной хроматографией
Хроматографирование. Экстракт из воды можно хроматографировать, минуя стадию очистки на хроматографической колонке. Погружают пластинку на глубину 0,5 см в подвижный растворитель (бензол и петролейный эфир в соотношении 6:4) и развивают на высоту 10 см. Пластинку сушат на воздухе несколько минут, затем 5 мин в сушильном шкафу при 100—105°С. Охлажденную пластинку опрыскивают проявляющим реактивом, а после высушивания хроматограмм — раствором уксусной или лимонной кислоты. Фозалон проявляется в виде голубого пятна на лимонно-желтом фоне. Пятна на пластинке сохраняются несколько минут. Rf фозалона 0,52—0,55. Чувствительность метода 3—5 мкг в анализируемой пробе. Для количественной оценки метод пригоден лишь в пределах 2—10 мкг препарата.
На хроматографическую пластинку «Силуфол» на расстоянии 15 мм от нижнего края при помощи микропипетки наносят 0,1 мл исследуемого экстракта, подсушивая точку нанесения при помощи фена. Слева и справа от пробы на расстоянии 20 мм наносят 0,2; 0,5 и 1 мл стандартного раствора фозалона. Пластинку с нанесенным раствором помещают в эксикатор, на дно которого установлена чашка Петри с подвижным растворителем бензолом. После того как растворитель поднимется на пластинке на высоту 10 см, пластинку вынимают из камеры и сушат в течение 1 мин под током воздуха в вытяжном шкафу.
Для проявления препарата пластинку опрыскивают проявляющим реагентом,
сушат под током воздуха 2 мин и облучают ультрафиолетовыми лучами.
Фозалон проявляется в виде пятна синего цвета.
Величина Rf препарата 0,34—0,36.
Расчет. Содержание фозалона в пробе (X, мг/кг, мг/л) рассчитывают по фор-
муле
Х = А/Р
где А — количество препарата, найденное на пластинке в анализируемой про-
бе, мкг; Р — навеска, или объем анализируемой пробы, г, мл.
Методические указания по определению фталофоса и фозалона методом тонкослойной хроматографии
Принцип метода. Метод основан на извлечении препаратов из пробы органическим растворителем, очистке экстрактов из исследуемых объектов с помощью колоночной хроматографии и перераспределения в не смешиваюшихся растворителях, концентрировании экстрактов и хроматографическом определении фталофоса и фозалона в тонком слое сорбента. Обнаружение препаратов на хроматограмме проводят после обработки пластинок бромфеноловым проявляющим реактивом с последующим обесцвечиванием фона раствором лимонной или уксусной кислоты. Обнаружение фозалона проводят также по хлориминфенолу, образующемуся после щелочного гидролиза препарата, путем опрыскивания хроматограммы растворами 4-аминоантипирина и феррицианида калия.
Метрологическая характеристика метода. Нижний предел определения
пестицидов 0,5—3,0 мкг в пробе. На пластинках с силикагелем предел обнаружения в 4 раза выше.
Степень определения составляет 85±9%.
Реактивы и растворы. Гексан х. ч. Хлороформ х. ч. Ацетон х. ч. Силикагель
КСК и АСК Бензол х. ч. Крахмал. Гипс. Проявляющие реагенты: бромфеноловый реактив — 0,05 г бромфенолового синего растворяют в 10 мл ацетона и доводят до 100 мл 1%-ным раствором азотнокислого серебра в водном ацетоне (ацетон н вода 3:1); лимонная кислота, 1%-ный раствор; уксусная кислота, 10%-ный раствор; 4-аминоантипирин, 2%-ный раствор; феррицианид калия, 10%-ный раствор; едкий натр, 5%-ный раствор. Стандартные растворы фталофоса и фозалона в гексане 100 мкг/мл.
Приборы и посуда. Колбы конические с притертыми пробками на 100—150
мл. Цилиндры мерные на 100 мл. Воронки делительные на 100—250 мл. Воронки химические. Чашки фарфоровые на 20 и 100 мл. Ступка фарфоровая. Пульверизаторы стеклянные. Пластинки стеклянные (9х12 см). Палочки стеклянные. Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл. Ножницы. Хроматографическая камера (можно использовать эксикатор). Камера для опрыскивания хроматограмм. Сито 100 меш. Мельница для размалывания гранулированного силикагеля. Весы технические. Весы аналитические. Сушильный шкаф. Прибор для встряхивания. Прибор для вакуумной отгон-ки растворителя. Баня водяная. Хроматографические пластинки «Силуфол UV-254».
Пластинки с тонким слоем силикагеля. Хроматографические колонки высотой 25см, внутренний диаметр 1,5 см.
Подготовка к определению.
Приготовление пластинок для хроматографирования. Стеклянные пластинки размером 9х12 см моют хромовой смесью, дистиллированной водой, сушат, протирают спиртом или эфиром и покрывают сорбционной массой. Для приготовления сорбционной массы используют две прописи: 1) берут 20,0 г силикагеля КСК, просеянного через сито 100 меш., 0,5 г крахмала, 63 мл дистиллированной воды, крахмал заваривают в 10 мл воды, доливают остальную воду, засыпают силикагель и хорошо перемешивают; 2) смешивают в фарфоровой ступке 35 г силикагеля, просеянного через сито 100 меш., с 2 г гипса; смесь переносят в коническую колбу с притертой пробкой, приливают 90 мл дистиллированной воды и встряхивают в течение 15 мин. Приготовленную массу в количестве 10 г наносят на каждую пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Пластинки сушат в течение
16—20 ч при комнатной температуре в горизонтальном положении. Готовые пластинки хранят в эксикаторе.
Подготовка хроматографических колонок. В нижнюю узкую часть колонки помещают небольшой тампон ваты, предварительно промытой в гексане и высушенной, затем насыпают силикагель АСК на высоту 18 см и уплотняют его, постукивая по колонке. Перед работой колонку промывают 20 мл гексана.
Ход анализа.
Экстракция и очистка экстракта при определении фталофоса и фозалон. 200 мл мочи наливают в делительную воронку и трижды экстрагируют фталофос и фозалон хлороформом порциями по 30, 20 и 10 мл, периодически встряхивая воронку в течение соответственно 30, 20 и 10 мин. Экстракты переносят в колбу, сушат безводным сульфатом натрия (10 г) в течение 30 мин и фильтруют в фарфоровую чашку или колбу для отгонки растворителя. Колбу с сульфатом натрия дважды промывают хлороформом порциями по 10 мл, хлороформ пропускают через тот же фильтр. Затем растворитель испаряют либо из фарфоровой чашки на водяной бане при температуре 60°С, либо при использовании вакуумного ротационного испарителя. Из колбы испарителя сухой остаток смывают 10 мл хлороформа, которые переносят в фарфоровую чашку. Хлороформ испаряют. После удаления растворителя из фарфоровой чашки сухой остаток со стенок смывают 2—5 мл хлороформа, который испаряют на воздухе, а затем проводят хроматографирование, как описано ниже.
20 г внутренних органов измельчают тщательно измельчают ножницами, помещают в колбу с притертой пробкой и проводят экстрагирование препаратов гексаном дважды порциями по 30 и 10 мл, встряхивая соответственно в течение 60 и 10 мин. Экстракты объединяют и пропускают через колонку, заполненную силикагелем АСК. Затем колонку промывают 100 мл элюирующей смеси петролейного эфира и ацетона в соотношении 9:1, пропуская ее небольшими порциями (15—20 мл). Экстракт концентрируют либо при использовании вакуумного ротационного испарителя при температуре 50°С, либо на воздухе без нагревания.
Сухой остаток смывают трижды по 5 мл дистиллированной водой и раствор пропускают в делительную воронку через фильтр, смоченный водой. Из водного раствора препараты извлекают хлороформом, экстрагируя двумя порциями растворителя по 10 мл в течение соответственно 30 и 10 мин. Хлороформные экстракты сливают в мерные колбы через фильтр с безводным сульфатом натрия. Фильтр промывают двумя порциями хлороформа по 5 мл. Объём экстракта доводят до метки.
Аликвоту экстракта помещают в фарфоровою чашку и испаряют до сухого остатка. Сухой остаток, образовавшийся в фарфоровой чашке после испарения экстрактов из проб, смывают дважды порциями гексана по 0,2 мл, который с помощью капилляра наносят на хроматографическую пластинку «Силуфол» или на пластинку с силикагелем, закрепленным крахмалом, на расстоянии 1,5 см от края в одну точку так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Слева и справа от пробы на расстоянии 2 см наносят стандартные растворы фталофоса и фозалона, содержащие предполагаемые в пробе количества (1—30 мкг).
Хроматографирование при определении фталофоса и фозалона. Пластинку помещают в камеру для хроматографирования, куда за 30 мин до
анализа наливают подвижный растворитель—смесь хлороформа и бензола (2:1). После того как фронт растворителя поднимется на 10 см от стартовой линии, пластинку вынимают и оставляют на несколько минут в вытяжном шкафу для испарения растворителя.
Хроматограмму опрыскивают бромфеноловым проявляющим реактивом, а через 5 мин — 1%-ным раствором лимонной кислоты. При наличии в пробе фталофоса и фозалона на желтом фоне пластинки проявляются синие пятна, соответствующие по цвету и значению Rf пятнам стандартных растворов. Значения Rf фталофоса на пластинках «Силуфол»— 0,63±0,05, фозалона — 0,83±0,05; в тонком слое силикагеля значение Rf соответственно равно 0,4±0,05 и 0,6±0,05. Метаболит фталофоса — фталимид — проявляется на пластинках «Силуфол» в виде пятна зеленоватого цвета с Rf 0,9±0,02.
Для идентификации фозалона на пластинках «Силуфол» рекомендуется также использовать селективный проявляющий реактив 4-аминоантипирин. Пластинку опрыскивают 5%-ным раствором едкого натра и нагревают в термостате при 100°С в течение 10 мин. Затем пластинку вынимают и опрыскивают последовательно 2%-ным раствором 4-аминоантипирина и 10%-ным раствором феррицианида калия. Фозалон проявляется в виде пятна бордово-коричневого цвета на слабо-желтом фоне
пластинки.
Фталофос
Фталофос (имидан)— 0,0-диметил-(N-фтальимидометил)-дитио-фосфат. Хи-
мически чистый препарат — белое кристаллическое вещество с температурой плавления 72—72,7°С. В 1 л воды при 25°С растворяется около 25 мг препарата. Он хорошо растворим в ацетоне, метилэтилкетоне. циклогексаноне и других органических растворителях. Исключение составляют алифатические углеводороды, из которых препарат труднорастворим. Фталофос выпускается в виде 20%-ного эмульгирующегося концентрата, 50%-ного смачивающегося порошка и 10%-ного гранулированного препарата.
Принцип метода. Метод основан на извлечении препарата из пробы ацетоном и последующем хроматографировании в тонком слое окиси алюминия. Подвижным растворителем служит смесь гексана с метанолом (19:7). Проявляют фталофос раствором азотнокислого серебра, которое при взаимодействии с продуктами гидролиза препарата щелочью дает темно-серые пятна на белом фоне.
Количественное определение фталофоса проводят путем сравнения интенсивности окраски и размеров пятен проб со стандартной шкалой. Чувствительность метода 1 мкг в пробе.
Реактивы и растворы. Ацетон х. ч. Хлороформ х. ч. Уксусная кислота ледя-
ная. 20%-ный водный раствор едкого натра. Метиловый спирт. 1%-ный водный раствор азотнокислого серебра. Окись алюминия для хроматографии. Гипс медицинский. Фталофос х. ч.
Приборы и посуда. Хроматографическая камера (стеклянный цилиндрический сосуд с притертой крышкой). Гомогенизатор для измельчения тканей. Центрифуга (8 тыс. об/мин). Делительные воронки на 150 мл. Бюксы стеклянные на 50—100 мл. Пульверизаторы. Пипетки разные. Микропипетки. Фильтры бумажные обеззоленные. Пластинки фотографические 13х18 см или «Силуфол». Стеклянный или металлический валик с ограничительными кольцами для нанесения слоя окиси алюминия с гипсом.
Приготовление пластинок. В качестве сорбента используют смесь, состоящую из 98 массовых частей окиси алюминия и 7 массовых частей медицинского гипса. На матовую поверхность стеклянной пластинки насыпают сорбент и разравнивают его валиком с ограничительными кольцами по всей поверхности ровным слоем толщиной 0,2 мм. Для закрепления слоя пластинку выдерживают 30—40 с над водяным паром, затем орошают из пульверизатора 5%-ным водным раствором уксусной кислоты до полного насыщения сорбента, что отчетливо видно по образованию глянца. Пластинки сушат в горизонтальном положении при комнатной температуре 18 ч, после чего они готовы к употреблению.
Ход анализа.
25 г ткани органа заливают 5-10 мл ацетона, гомогенизируют 1—2 мин при 1000 об/мин. Гомогенат заливают 50 мл ацетона, оставляют на 1 ч при комнатной температуре, после чего экстракт центрифугируют 15 мин при 8000 об/мин.
Водно-ацетоновый слой фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку, добавляют 20 мл хлороформа и перемешивают вращением и легким покачиванием воронки. После расслоения нижний ацетоно-хлороформный слой отделяют и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу.
Кровь. Моча. К 10 мл пробы добавляют 20 мл ацетона. Дальнейший ход анализа молока такой же, как для внутренних органов.
Хроматографирование. После выпаривания хлороформа сухой остаток из аликвоты экстракта растворяют в 0,5 мл ацетона и наносят на пластинку. Пластинку помещают в хроматографическую камеру с системой гексан — метанол (19:1). Растворители наливают в камеру за 2 ч до хроматографирования. После того как фронт растворителя поднимется на высоту 10 см, пластинку вынимают из камеры и подсушивают 10—15 мин на воздухе, чтобы испарились растворители. Затем пластинку опрыскивают 20%-ным раствором едкого натра до насыщения, а через 10 мин—1%-ным раствором азотнокислого серебра. Фталофос проявляется в виде темно-серых пятен на белом фоне с Rf 0,62.
Количественное определение фталофоса проводят путем сравнения интенсивности окраски и размеров пятен проб и стандартных растворов, которые хроматографируют одновременно.
Стандартную шкалу готовят следующим образом. Растворы фталофоса в аце-
тоне (1, 2, 5, 10 и 20 мкг препарата в 0,1 мл) Наносят на хроматографическую пластинку, разгоняют и проявляют. Размеры пятен измеряют и сравнивают визуально.
При расчете количества фталофоса учитывают, что описанной выше методикой экстрагируется в среднем 50% препарата.
Расчет. Содержание препарата вычисляют по формуле
Х = 2С/Р
где Х — количество препарата в продукте, мг кг; С — количество препарата,
найденное в пробе, мкг; Р — масса пробы, г; 2 — коэффициент экстракции.
Фосфамид (рогор, диметоат, БИ-58) - О,О-диметил-S-(N-метилкарбамоилметил)-дитиофосфат. Препарат хорошо растворим в большинстве органических растворителей, в воде (39 г/л), но плохо растворим в предельных углеводородах. Он является высокоэффективным инсектоакарицидом контактного и системного действия.
Принцип действия. Метод основан на извлечении ядохимикатов из органов и тканей хлороформом, а из крови и мочи ацетоном, очистке экстрактов от мешающих анализу коэкстрактив-ных веществ путем перераспределения в несмешивающихся растворителях, концентрировании экстрактов и хроматографировании антио и фосфамида в тонком слое сорбента в системе растворителей хлороформ —ацетон в соотношении 9:1. Для проявления ядохимикатов применяют раствор бромфенолового синего в смеси с азотнокислым серебром. Чувствительность метода 0,2мг/кг (л), процент определения в пробах, содержащих 3—10 мкг пестицидов, в среднем составляет 83±15,6.
Реактивы и растворы. Хлороформ х. ч. Ацетон х. ч. Едкий натр или едкий
калий. Серебро азотнокислое. Силикагель марки КСК. Гипс. Сульфат натрия безводный. Антио 90%-ный. Фосфамид 96%-ный. Аммиак 25%-ной концентрации (уд. вес 0,9). Проявитель: 0,05%-ный раствор бромфенолового синего в 1%-ном водно-ацетоновом растворе азотнокислого серебра (вода — ацетон 1:3).
Приборы и посуда. Хроматографическая камера. Весы аналитические. Дели-
тельные воронки на 150 мл. Пульверизаторы. Шуттель-аппарат. Микропипетки. Фильтры бумажные. Чашки фарфоровые выпарительные на
20 и 100 мл. Водяная баня. Стеклянные пластинки 9х12 см. Сушильный шкаф. Фарфоровая ступка. Конические колбы с притертыми пробками на 150 и 200 мл. Воронки для фильтрования. Мерные пипетки на 2 и 5 мл. Сито на 100 меш. Камера для опрыскивания хроматографических пластинок. Мельница для размалывания гранулированного силикагеля.
Приготовление пластинок с тонким слоем сорбента. Стеклянные пластинки размером 9х12 см моют хромовой смесью, затем водопроводной и дистиллированной водой и сушат в вертикальном положении. Сухие пластинки перед нанесением на них сорбционной массы протирают спиртом или эфиром. Для приготовления сорбционной массы в фарфоровую ступку вносят 35 г силикагеля КСК, просеянного через сито 100 меш., 2 г гипса и тщательно перемешивают, затем переносят в коническую колбу с притертой пробкой. Приливают 90 мл дистиллированной воды и энергично встряхивают в течение 15 мин. Приготовленную массу в количестве 10 г наносят на пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Пластинки сушат в течение 16—20 ч при комнатной температуре в строго горизонтальном положении. Готовые пластинки хранят в эксикаторе. Можно использовать пластинки «Силуфол».
Ход определения. Исследуемую пробу патологического материала (печень, головной мозг, почки, мышечную ткань, содержимое желудка и т. д.) измельчают ножницами, берут навеску в 20 г, помещают в коническую колбу с притертой пробкой и проводят экстрагирование ядохимикатов хлороформом дважды порциями по 40 и 20 мл, встряхивая в течение 30 и 3 мин соответственно. Экстракты отделяют фильтрованием через бумажный фильтр в выпарительную чашку, объединяют и концентрируют без нагрева в вытяжном шкафу досуха.
Исследуемую пробу крови и мочи в объеме 10 мл вносят в мерный цилиндр с притертой пробкой емкостью на 100 мл, приливают 40 мл ацетона, экстрагируют встряхиванием в течение 3 мин и скоагулированную массу отделяют фильтрованием через бумажный фильтр, а водно-ацетоновый экстракт собирают в делительную воронку, приливают 40 мл хлороформа и экстрагируют встряхиванием в течение 3 мин. Отделившийся хлороформно-ацетоновый экстракт сливают через бумажный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в фарфоровую выпарительную чашку и концентрируют без нагрева в вытяжном шкафу досуха. Для извлечения антио и фосфамида из сухого остатка экстрагирование проводят дистиллированной водой трижды: порциями по 3 мл, тщательно растирая остаток стеклянной палочкой. Экстракты собирают через бумажный фильтр в делительную воронку, объединяют и для извлечения пестицидов из водного раствора экстрагирование проводят хлороформом дважды порциями по 10мл, встряхивая по 1 мин.
Хлороформные экстракты сливают в фарфоровую чашку через фильтр с безводным сульфатом натрия, предварительно промытым хлороформом. Экстракты объединяют и собирают в мерные колбы.
Аликвоту экстракта выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,2 мл хлороформа, который с помощью микропипетки наносят на пластинку со слоем сорбента. Это выполняют трижды.
Для идентификации пятен пестицидов и их количественной оценки на ту же
пластинку наносят стандартные растворы антио и фосфамида, содержащие предполагаемые количества в пробе, и пластинку помещают в хроматографическую камеру с подвижной системой растворителей хлороформ — ацетон (9:1). После подъема фронта подвижной фазы на 10 см от линии старта пластинку вынимают и сушат в вытяжном шкафу до испарения растворителей. Хроматограмму обрабатывают из пульверизатора смесью водно-ацетонового раствора бромфенолового синего и азот-нокислого серебра и помещают в сушильный шкаф на 5—7 мин при 50°С.
После охлаждения пластинку опрыскивают 10%-ным раствором уксусной кислоты или 2%-ным раствором лимонной кислоты для удаления маскирующего фона. На желтоватом фоне пластинки пестициды проявляются в виде темно-синих пятен, соответствующие по цвету и величине Rf пятнам стандартных растворов. Для антио Rf 0,74±0,04, для фосфамида—0,45±0,03. Метод специфичен в присутствии других фосфорорганических пестицидов. Так, рицид проявляется с Rf 0,64±0,03, метилнитрофос с Rf 0,27±0,02 и тиофос с Rf 0,18±0,02.
Количественное определение пестицидов проводят путем визуального сравнения интенсивности окраски пятен пробы и их величины с пятнами стандартных растворов.
Расчет производят по формуле
Х = А/Р
где X — содержание пестицидов в пробе, мг/кг; А — количество пестицидов в
пробе, найденное путем сравнения с пятнами стандартных растворов, мкг; Р — масса (объем) исследуемой пробы, г или мл.
Карбофос.
Принцип метода. Метод основан на извлечении инсектицида из исследуемой пробы ацетоном, очистке экстракта от липидов 60%-ным водным раствором этилового спирта и идентификации карбофоса в тонком слое «Силуфола» после опрыскивания пластинок 2,6-дибром-N-хлорхинонимином с последующим нагреванием при 105°С.
Реактивы и растворы. Ацетон ч. д. а. Гексан. Хлороформ. Ледяная уксусная
кислота. Натрий сернокислый безводный. 60%-ный этиловый спирт. Смесь петролейного и серного эфиров в соотношении 3:2. Соляная кислота 2 н. 2,6-дибром-N-хлорхинонимин, 0,5%-ный раствор в гексане. 80%-ный водный раствор ацетона.
Стандартный раствор карбофоса в этиловом спирте 10 мкг/мл.
Приборы и посуда. Микроизмельчитель тканей. Центрифуга. Магнитная мешалка. Прибор для вакуум-отгонки. Вакуум-насос. Водяная баня. Камера для хроматографирования. Микропипетка. Пульверизатор стеклянный. Фарфоровые выпарительные чашки. Стеклянные конусовидные выпарительные чашки на 30 мл. Делительные воронки на 50 и 100 мл. Пластинки «Силуфол».
Ход анализа.
Экстракция и очистка экстракта из органов и тканей.
Пробу тканей 25 г, предварительно измельченных ножницами, переносят в сосуд для гомогенизации и заливают при анализе мышц 50 мл, а при анализе других тканей 25 мл 80%-ного водного раствора ацетона, подкисленного 2 н. соляной кислотой (10 мл кислоты на 100 мл экстрагента). Ткань измельчают, в полученный гомогенат добавляют еще 25 мл подкисленного водного раствора ацетона и переносят в охлажденную пробирку. Пробы помещают в холодильник на 30 мин, а затем центрифугируют при 2500 об/мин в течение 20 мин. Полученный верхний слой осторожно переносят в колбу перегонного аппарата (при необходимости фильтруют), а остаток промывают 25 мл подкисленного 80%-ного ацетона, которым предварительно ополаскивают сосуд для гомогенизации. Пробу еще раз центрифугируют в течение 20 мин и верхний слой переносят в ту же колбу перегонного аппарата.
В водно-ацетоновый экстракт добавляют 5 мл насыщенного раствора поваренной соли и отгоняют под вакуумом при температуре 40—48°С до исчезновения запаха ацетона (10—15 мин). После отгонки водную фазу (остаток) охлаждают под струей воды и переносят в делительную воронку. Затем колбу перегонного аппарата двукратно смывают 50 мл смеси эфиров и переносят в ту же делительную воронку. Воронку встряхивают интенсивно в течение 5 мин. Слоям жидкости дают разделиться, после чего нижний слой сливают через кран и отбрасывают, а эфирный слой переносят через горловину воронки в выпарительную чашку, куда предварительно вносят 5 мл 60%-ного этилового спирта.
Эфиры полностью испаряют под тягой вытяжного шкафа до образования беловатой пленки на поверхности оставшегося водно-спиртового раствора. Этот остаток пропускают через плотный бумажный фильтр, смоченный дистиллированной водой, в делительную воронку. Затем выпарительную чашку смывают 3 мл 60%-ного этанола и 8 мл дистиллированной воды, которые фильтруют в ту же воронку, и экстрагируют препарат 15 мл смеси эфиров в течение 2 мин. Слоям дают разделиться, после чего нижний слой отбрасывают, а эфирный сушат 0,3 г сернокислого безводного натрия и переносят через горловину воронки в конусовидную стеклянную выпарительную чашку. Воронку ополаскивают еще раз 3 мл смеси эфиров и переносят в ту же выпарительную чашку. Экстракт выпаривают до 0,1 мл и наносят на хроматографическую пластинку «Силуфол» на расстоянии 1,5 см от края при помощи микропипетки так, чтобы диаметр пятна не превышал 0,5 см. Выпарительную чашку смывают 0,1 мл смеси эфиров, которую также наносят на пластинку в центр первого пятна.
Экстракция и очистка экстракта из жира. Пробу жира 25 г, предварительно измельченного ножницами, заливают в плоскодонной колбе 75 мл 80%-ного водного раствора ацетона и встряхивают на магнитной мешалке в течение 30 мин на холоде (при температуре от 0 до минус 4°С). Полученный раствор фильтруют в колбу перегонного аппарата, добавляют в эту же колбу 5 мл насыщенного раствора хлористого натрия и ведут дальнейший анализ так же, как и при определении карбофоса в других тканях
Хроматографирование. Пластинку с нанесенными растворами помещают в
камеру с системой растворителей — смеси хлороформа и гексана (10:1). Хроматографирование проводят до тех пор, пока подвижный растворитель не достигнет уровня 1 см от верхнего края пластинки. После этого пластинку вынимают из камеры, сушат и опрыскивают 0,5%-ным раствором 2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане, а затем помещают в сушильный шкаф температурой 105°С. Через 5—10 мин при наличии в исследуемой пробе карбофоса на пластинке проявляются долго сохраняющиеся пятна розово-красного цвета, величина Rf равна 0,52—0,56.
Обработка результатов анализа. Для определения метаболитов карбофоса
дополнительно используют систему растворителей — смесь гексана, уксусной кислоты и диэтилового эфира (75:15:10). 3 этом случае карбофос и его метаболиты проявляются в виде розово-красных дуг.
Количественное определение препарата проводят путем измерения площадей
пятен пробы и стандартов, учитывая визуально также интенсивность их окрасок.
Расчет: содержание количества пестицида в анализируемой пробе (X, мг/кг,
мг/л) рассчитывают по формуле
Х = А/Р
где А — количество препарата, найденного на пластинке в анализируемой пробе, мкг; Р — навеска или объем анализируемого образца, г, мл.
Методические указания по определению севина в биологических материалах методом тонкослойной хроматографии
Краткая характеристика препарата. Севин (карбарил) —1-нафтил-N-метилкарбамат. С12Н11О2N. Молекулярная масса 201,23. Высокоэффективный инсектоакарицид с широким спектром действия. Химически чистый препарат представляет собой бесцветные кристаллы без запаха. Тпл 142°С. Давление паров менее 0,005 мм рт.ст. при 26°С. В 1 л воды комнатной температуры растворяется 0,099 г севина. В большинстве органических растворителей (хлороформ, ацетон, гексан и др.) препа- рат растворяется хорошо. Устойчив в нейтральной и кислой среде. В щелочных растворах (рН 10) быстро гидролизуется до 1-нафтола. Устойчив на свету, при повышенных температурах и хранении. При сильном нагревании разрушается до 1-нафтола и метилизоционата. Выпускается в виде 85%-ного смачивающегося порошка. Используется для защиты растений, в ветеринарной практике — для борьбы с различными эктопаразитами сельскохозяйственных животных.
Принцип метода. Метод основан на экстракции препарата гексаном или хлороформом, хроматографировании на пластинках «Силуфол», гидролизе препарата спиртовым раствором щелочи до 1-нафтола и образовании соединения с солью диазония — прочный синий Б или прочный красный ГГ. Использование для проявления хроматограмм готовых стабилизированных солей диазония (диазоле) прочный синий Б и прочный красный ГГ позволило в несколько раз понизить предел определения и значительно упростить выполнение исследования.
Метрологическая характеристика метода. Нижний предел определения
0,01—0,001 мг/кг. Степень определения 75%.
Реактивы и растворы. Спирт этиловый. Гексан х. ч. Хлороформ х. ч. Ацетон х. ч. Прочный синий Б (или прочный красный ГГ). Кали едкое ч., х. ч. (15%-ный раствор на 60%-ном спирте). Натрий сернокислый безводный. Петролейный эфир ч., х. ч. Натрий хлористый. Уксусная кислота, 0,25 н. раствор.
Приборы и посуда. Хроматографические пластинки «Силуфол». Камера хроматографическая. Чашки выпарительные фарфоровые. Вакуумный ротационный испаритель. Пульверизаторы стеклянные (химические). Химическая посуда (пипетки, воронки, воронки делительные, стаканы химические, колбы).
Подготовка к определению. Ткани внутренних органов тщательно измельчают ножницами или в гомогенизаторе.
Ход анализа.
Экстракция и очистка экстракта из тканей (мышцы, печень, почки, легкие, сердце). К 2—3 г измельченной ткани приливают 5 мл гексана и прибавляют 2—3 г безводного сернокислого натрия. После этого ткани растирают пестиком и вместе с экстрагентом переносят в колбу для экстракции. Общий объем растворителя при этом должен составлять 30—50 мл. Экстрагирование проводят в течение 2—3 ч при периодическом перемешивании пробы. Если необходимо, то экстракт можно оставлять в таком состоянии до следующего дня. После этого экстракт отфильтровывают и упаривают в вакуумном ротационном испарителе или в выпарительных чашках при температуре не выше 60—70°С. Особенно осторожно нужно уд
