Методика определения карбоксигемоглобина (без насыщения)

Готовят 0,5% раствор исследуемой крови в 0,1% растворе аммиака, полученную смесь фильтруют через складчатый фильтр и снимают спектр в интервале от 500нм до 600нм на спектрофотометре, в кювете толщиной слоя 1 см,раствор сравнения 0,1 % раствор аммиака. Записывают спектр поглощения раствора испытуемой крови. Затем в измерительную и сравнительную кюветы добавляют по 4 мг дитионита натрия, осторожно перемешивают и снова записывают при тех же длинах волн оптические плотности.

Оценка результата. Сохранение двух максимумов при втором измерении, после добавления дитионита натрия, является качественной характеристикой наличия в исследуемой пробе карбоксигемоглобина.

Содержание карбоксигемоглобина в % вычисляется по значениям оптической плотности раствора крови после добавления дитионита натрия в максимуме при 540 нм – D1 и при 550 нм – D2. Коэффициенты К1=0.77 и К2=0.37.

(D1 – D2*К1)*100

% СОНb = -----------------------------

(D2*К2)

Примечание:

Расчет коэффициентов К1 и К2 находили по результатам 10 модельных определений. При этом образцы крови насыщают кислородом и окисью углерода. Коэффициенты рассчитывают по формуле:

К2=(D₃-D₀)/D₂ и К1=D₀/D₂ ,

где: D₀ – оптическая плотность обработанного дитионитом натрия раствора крови, содержащего дезоксигемоглобин и не содержащего карбоксигемоглобин при аналитической длине волны;

D2 – оптическая плотность раствора крови, обработанного дитионитом натрия при длине волны в изобестической точке;

D3 – оптическая плотность раствора крови, дополнительно насыщенного окисью углерода при выбранной «аналитической» длине волны.

Насыщение образцов крови кислородом производят, пропуская кислород через раствор крови в течение 10 минут. При этом кровь освобождается от метгемоглобина и остаточного карбоксигемоглобина.

Методика насыщения крови СО (II). Насыщенный оксидом углерода (II) раствор крови получают в специальном приборе, который состоит из колбы, закрытой пробкой, снабженной капельной воронкой и отводной стеклянной трубкой для выхода оксида углерода (II) из колбы, четырех склянок Дрекселя и отводной трубки. Колбу и склянки Дрекселя соединяют между собой резиновыми трубками. При отсутствии склянок Дрекселя их можно заменить колбами вместимостью 50 мл, отверстия которых закрыты пробками, снабженными двумя стеклянными трубками.

В первую колбу вносят 50 мл концентрированной серной кислоты, а в капельную воронку — 10 мл муравьиной кислоты. В 1-ю склянку Дрекселя вносят 10 %-й раствор гидроксида натрия, во 2-ю и 3-ю склянки — дистиллированную воду, а в 4-ю склянку — ½ часть раствора исследуемой крови в 0,1% растворе аммиака, предварительно насыщенной кислородом. В склянки вносят столько жидкости, чтобы трубки погружались на 2 см в жидкость.

Из капельной воронки в подогретую колбу / по каплям приливают муравьиную кислоту. Интенсивность выделения оксида углерода (II) регулируют скоростью приливания муравьиной кислоты. По мере расходования муравьиной кислоты выделение газа замедляется. В начале опыта для увеличения скорости выделения оксида углерода (II) колбу осторожно нагревают на небольшом пламени газовой горелки.

Учитывая высокую токсичность оксида углерода (II), при работе с ним необходимо соблюдать осторожность. Получение оксида углерода (II) и насыщение крови этим газом должно производиться в вытяжном шкафу с хорошей тягой.

Оксид углерода (II) из колбы пропускают через склянки Дрекселя в течение 15 мин. За это время оксигемоглобин крови полностью превращается в карбоксигемоглобин. Однако при этом в растворе может оставаться некоторое количество метгемоглобина, который необходимо перевести в дезоксигемоглобин, а затем в карбоксигемоглобин. С указанной целью после пятиминутного пропускания оксида углерода (II) от прибора отсоединяют склянку с раствором исследуемой крови, в которую вносят 5—7 мг дитионита натрия, и жидкость хорошо взбалтывают. (Осторожно! Не вдыхать оксид углерода (II)!). Затем склянку 4 присоединяют к прибору и в течение 5 мин пропускают оксид углерода (II). После насыщения оксидом углерода (II) раствор крови, содержащий карбоксигемоглобин, должен быть прозрачным.

Значение коэффициентов К1 и К2 рекомендуется проверять не реже 1 раза в год.