Постфиксация

При альдегидной фиксации ненасыщенные липиды и фосфолипипиды не стабилизируются, для их сохранения требуется дополнительная фиксация («постфиксация»). Для этого используют 1% раствор тетраоксида осмия (OsO₄). Осмиевые фиксаторы прежде всего взаимодействует с липидами и беками по месту двойных связей. Нуклеиновые кислоты и углеводы почти не взаимодействуют с тетраоксидом осмия, если они не связаны с белками. Раствор тетраоксида осмия очень медленно проникает в ткань (0,75 мм/час), поэтому продолжительность фиксации кусочка ткани размером 1 мм³ составляет 60-90 мин. Пары четырехокиси осмия раздражают дыхательные пути и могут вызвать тяжелые поражения глаз.

Сочетание первичной фиксации глутаровым альдегидом с последующей дополнительной фиксацией в четырехокиси осмия получило название метода «двойной фиксации». В настоящее время это наиболее распространенный метод сохранения ткани. Этот метод сочетает в себе преимущества 2 фиксаторов: сохраняются и белки, и липиды.

Дегидратация (обезвоживание).

Для того, чтобы приготовить из фиксированной ткани достаточно тонкие для электронной микроскопии срезы, необходимо пропитать эту ткань материалом для заливки, который будет ее поддерживать и сведет повреждения при резке к минимуму. Среды для заливки, наиболее часто применяемые в электронной микроскопии, не смешиваются с водой. Следовательно, для того чтобы ткань полностью пропиталась заливочной средой, вода в ткани должна быть замещена каким-либо веществом, способным смешиваться с заливочной средой. С этой целью ткань предварительно подвергают обезвоживанию.

Если из фиксатора ткань сразу же перенести в 100%-ный этанол, то могут возникать механические повреждения вследствие изменения поверхностного натяжения и токов, образующихся при смешивании этих жидкостей. Для уменьшения повреждений ткань «проводится» по ряду спиртов возрастающей концентрации: 50% → 60% → 70% → 80% → 96% → 100%. После серии спиртов используется ацетон.

Позитивное контрастирование.

Как правило, при дегидратации материала используют не чистый 70°С спирт, а 1,5% раствор уранилацетата в 70°С спирте. Соли тяжелых металлов, связываясь со структурами клетки, повышают их электронную плотность.