Окрашивание ультратонких срезов

Следует отметить, что термин «окрашивание» по отношению к ультратонким срезам нельзя считать точным, т.к. изображение их черно-белое. Однако, он широко распространен наряду с более точным термином «контрастирование»,

Как уже отмечалось выше, электронно-микроскопическое изображение создается благодаря рассеиванию образцом пучка электронов. Количество электронов, рассеиваемых каждой точкой объекта, зависит от толщины среза и атомного веса составляющих его атомов. Рассеивание увеличивается пропорционально массе элемента. Биологические образцы состоят главным образом из элементов с низким атомным числом: углерода, водорода, кислорода, азота. Исключение составляют, пожалуй, только эритроциты, содержащие тяжелый элемент – железо. Используемые эпоксидные смолы – это органические вещества, следовательно, они состоят из перечисленных легких элементов. В связи с эти различия в отклонении электронов смолой и образцом, а также отдельными компонентами образца, невелики. Изображения в трансмиссионном электронном микроскопе малоконтрастны.

Для усиления рассеивания электронов в микроскоп вводят атомы тяжелых металлов: осмия, вольфрама, рутения, урана, свинца. Таким образом, изображение в электронном микроскопе представляет собой картину, отражающую распределение атомов тяжелых металлов в структурах образца. Структуры, связавшие большое количество этих атомов, сильнее отклоняют электроны и предоставляются более темными на экране и более светлыми на негативе. Соединения тяжелых металлов в образец вводятся:

1) при фиксации (осмий);

2) при дегридатации (уранилуцетат);

3) в ультратонкие срезы.

Наиболее эффективным способом усиления контраста является окрашивание ультратонких срезов. Для более высокого контрастирования сначала срезы окрашиваются уранилацетатом (40 мин при температуре 37° С). Уранилацетат избирательно контрастирует структуры, содержащие нуклеиновые кислоты. Для окрашивания сетки с ультратонкими срезами просто помещают на поверхность капли раствора красителя. При этом заливочная среда не окрашивается, а окрашивается только ткань.

После обработки срезов уранилацетом используют свинец. Свинец контрастирует многие клеточные компоненты. Наиболее популярно контрастирование свинцом по методу Рейнольдса (1963).

Полученные выше описанным способом сетки с ультратонкими срезами готовы для анализа при помощи трансмиссионного электронного микроскопа.