Культивирование клеток

Клетки можно культивировать как в стеклянной посуде, так и в пластиковой; но одно из главных условий ведения культуры – стерильность. Клетки прикрепляются к стеклу сосудов (стационарные однослойные культуры) или остаются во взвешенном состоянии во вращающихся сосудах (суспензионные культуры). Флаконы, используемые для культивирования клеток, на «лабораторном» языке называют «матрасами».

Пассирование – процесс пересадки клеток. Необходимо, так как:1) в старом флаконе заканчивается питательная среда; 2) количество клеток значительно увеличивается. Для пассирования необходимо клетки разделить друг от друга и от подложки. Для этого используют:

1) хелаты – вещества, удаляющие кальций: ЭДТА – 0,2% его раствор называется версеном;

2) ферменты: 0,25% раствор трипсина («откусывает» белки).

Первичная культура – культура клеток, полученная непосредственно из ткани или органа организма; как правило, такие культуры сохраняются ограниченное число пассажей. Перевиваемые (стабильные) линии полностью адаптированы к существованию вне организма; их получают из нормальных или раковых тканей; размножаются неограниченно долгое время. Появление постоянной линии клеток констатируется по следующим морфологическим изменениям: уменьшение размера клеток, снижение адгезивности клеток, округление, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения, а также по: увеличению скорости роста, уменьшению зависимости от сыворотки и от субстрата, увеличению анеуплоидности.

Методика «съема клеток»:

1. Из «матраса» с клетками сливается старая среда.

2. В «матрас» наливается смесь версен:трипсин=3:1 (2мл). Это смесью производится только споласкивание (чтобы удалить остатки сыворотки).

3. Предыдущая смесь сливается и наливается смесь версен:трипсин=3:1 (5мл). «Матрас» ставится в термостат +37°С. время нахождения в термостате зависит от вида культуры.

4. По истечении необходимого времени смесь сливается и в «матрас» наливается 2-3 мл среды, «матрас» встряхивается.

5. Из «матраса» берется проба: в камере Горяева подсчитывается концентрация клеток, находящихся во взвеси. После этого определяется, во сколько надо развести среду, чтобы получилось концентрация 200 000 клеток на 1 мл среды.

6. Клетки переносятся в новый «матрас», в который добавляется 5 мл среды.

Среда.

Параллельно с созданием культур разрабатывались среды, в которых эти культуры будут содержаться. Среда должна обладать следующими характеристиками: иметь большую буферную емкость (чтобы скомпенсировать изменения pH), содержать все необходимые для жизнедеятельности клетки вещества (аминокислоты, микроэлементы и т.п.).

Источником гормонов и факторов роста является сыворотка, добавляемая в среду. Кроме того, сыворотка вносит в среду фибронектин (прикрепляет клетки к субстрату), альбумин, трансферрин (связывает ионы железа и доставляет их к клеткам), минеральные вещества. Сыворотка может быть человеческой, крупного рогатого скота (КРС), лошадиной, северного оленя. В зависимости от того, на какой стадии онтогенеза взяли кровь, сыворотка бывает: эмбриональной, новорожденного, взрослого.

Одной из наиболее распространенной сред является среда №199. Эта среда насыщенная, поэтому возможно ее использование с другими средами. Среда №199 содержит почти все аминокислоты и витамины, предшественники нуклеиновых кислот, факторы роста, липиды. Те элементы, которых нет в среде, восполняются добавлением 5-10% сыворотки.