Методи виділення і очищення ферментів

Вихідним матеріалом для отримання різних ферментів найчастіше служать органи і тканини тварин і рослин, травні соки, а також клітинна маса мікроорганізмів. Підбираючи матеріал, слід враховувати вид тварини. Зокрема, вміст b-глюкозидази в тканинах шести видів тварин може різко відрізнятися. Травні ферменти від тварин одержують фістульним методом І.П. Павлова. Часто для отримання ферментів використовують бактерійні маси, вирощені на певному середовищі. Так, при індукованому синтезі вміст кислої фосфатази в масі кишкової палички можна збільшити до 6% і більше.

Молекули ферментів зазвичай зв’язані із структурними білками, ліпідами і вуглеводами, які входять до складу органоїдів і клітинних мембран. Частина молекул ферментів знаходиться в біологічних рідинах у вільному стані. Щоб виділити ферменти, слід зруйнувати клітини, перевести ферменти в розчин і потім екстрагувати.

Матеріал, призначений для отримання ферментів, звільняють від домішок (органи – від сполучнотканинної капсули, жиру, крові та ін.). Свіжий матеріал зазвичай зберігають при низьких температурах (–20°С). Матеріал подрібнюють в гомогенізаторах, ультразвуком, за допомогою аутоліза, лізису, розтирання в ступці з піском і т.д. Іноді клітинні мембрани руйнують, обробляючи матеріал ацетоном (одержують безводний порошок, зручний для зберігання і екстракції). Для отримання ферментів з певних субклітинних структур матеріал гомогенізують і фракційно центрифугують. До окремих фракцій додають детергенти, наприклад „Твіни”. Під їх впливом руйнуються мембрани субклітинних структур і ферменти переходять в розчин. Для отримання екстрактів як розчинники використовують дистильовану воду, буферні розчини, фізіологічний розчин, суміш гліцерину і дистильованої води, органічні розчинники.

Очищення ферментів зазвичай є чергуванням різних методів фракціонування. Зокрема, більшість ферментів можна очистити, застосовуючи такі методи.

1. Фракціонування за допомогою органічних розчинників: ацетону, етанолу та ін.

2. Фракціонування з використанням адсорбції і елюції. Як адсорбенти застосовують гелі гідроксида алюмінію, ортофосфата кальцію, як елютанти – воду, буферні розчини і інші розчинники.

3. Фракціонування з різними концентраціями нейтральних солей, найчастіше – сульфату амонія.

4. Розділення ферментів за допомогою хроматографічної колонки.

5. Виділення ферментів з сумішей методом електрофореза на крохмальному гелі або на папері.

6. Отримання ферментів з розчинів методом кристалізації і перекристалізації.

Отримані ферменти перевіряють на чистоту. Для цього визначають константу седиментації, електрофоретичну рухливість при декількох значеннях рН, чистоту ферментативного препарату по кривій розчинності, досліджують імунологічні властивості препарату за допомогою антисироватки, а також вивчають електрофоретичні та хроматографічні властивості ферменту після дії трипсину.