Метод ELISA (рис. 91) для выявления концентрации факторов гемостаза, как правило, использует принцип «сендвича». На стенки микроплашки наносятся антитела к исследуемому фактору гемостаза (твердая фаза). После добавления плазмы происходит осаждение специфического антигена (белка системы гемостаза) на фиксированных антителах. Плашка промывается и заполняется вторичными антителами, взаимодействующими с этим же белком, но по другим эпитопам (антигенным структурам). Вторичные антитела конъюгированы с ферментом (ELISA), радиоактивной меткой (РИА), люминесцентной меткой (ЛИА). В тесте ELISA после отмывки несвязавшихся антител добавляется субстрат ферментативной реакции и хромоген. Изменение светопропускания раствора пропорционально количеству антигена (фактора), осажденного на фиксированных антителах. Методика позволяет оценить этот параметр количественно в концентрации <1 нг/мл, что достаточно для многих компонентов свертывающей системы.
Рис. 90. Принцип латекс-агглютинации. Латексные частицы, покрытые антителами против фактора гемостаза, при взаимодействии с этим фактором (антигеном) образуют агрегаты, видимые визуально или регистрируемые на соответствующих приборах
|
|
Рис. 91. Принцип ELISA. На плашке, покрытой антителами против фактора гемостаза, связывается антиген, Проявляющие антитела, конъюгированные с ферментом, связываются с антигеном. Фермент меняет цвет хромогена пропорционально количеству антигена
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
В настоящее время значительное развитие получают быстрые качественные и полуколичественные иммунохимические иммунодиффузион-ные методы, основанные на визуальном определении реакции антиген-антитело.
Радиальная иммунодиффузия
Метод радиальной иммунодиффузии (РИД) основан на образовании колец преципитации в результате взаимодействия специфических антител, содержащихся в геле, с анализируемым антигеном, помещаемым в углубления стандартного размера (рис. 92). В результате диффузии в геле растворимых антигенов кольцо преципитации образуется в зоне оптимального соотношения антиген/антитело. Площадь, ограниченная кольцом преципитации, пропорциональна количеству антигена.
«Ракетный» иммуноэлектрофорез
«Ракетный» иммуноэлектрофорез - иммунологический метод, сочетающий в себе электрофорез и иммунодиффузию (рис. 93). Метод дает возможность различить сходные по электрофоретической подвижности вещества с помощью специфической реакции преципитации между антигеном, помещаемым на гелевую (целлюлозо-ацетатную) пластинку, и соответствующими антителами, которые содержатся в ней. Длина «ракетных» иммунопреци-питатов пропорциональна концентрации антигена. Метод довольно прост в исполнении и обладает относительно высокой точностью.
|
|
При фундаментальном подходе к исследованиям компонентов гемостаза применение флуоресцентной или люминесцентной меток повышает чувствительность иммунохимических методов и расширяет спектр определяемых компонентов.
Ат | Ат | Ат |
Ат | Ат | |
Ат | Ат | Ат |
Ат | Ат | Ат |
Ат-Аг | ||
Ат Щ | О | Ат |
Ат-Аг | ||
Ат | Ат | Ат |
Рис. 92. Принцип метода радиальной иммунодиффузии,
используемый для полуколичественной оценки неко- Рис. 93. Принцип метода «ракетный» иммуноэлектро-
торых факторов гемостаза форез
Скрининговые тесты оценки плазменного звена гемостаза
Лабораторная диагностика нарушений системы гемостаза является одной из самых дорогостоящих в лабораторной практике. Выполнение всех возможных тестов для уточнения характера нарушений для всех пациентов - практически недоступная задача. Поэтому чрезвычайно важно соблюдать этапность проведения тестов, исходить из клинических данных и анамнеза пациента.
На первом этапе для уточнения направленности нарушений необходимо провести тесты, отражающие состояние целых звеньев системы гемостаза. Поскольку в разных лабораториях при анализе гемостаза преследуются разные цели, перечень тестов, входящих в гемостатический скрининг для данной лаборатории, может отличаться от такового в дру-
гих лабораториях. Однако существует набор тестов, традиционно называемых (и рекомендуемых) скри-нинговыми для диагностики состояния системы гемостаза. Обычно к ним относят определение времени кровотечения и несколько тестов, оценивающих состояние плазменного звена гемостаза, которые входят как основной компонент в понятие коа-гулограммы. Наиболее полно этапность разработана для диагностики геморрагических нарушений. Скрининговые тесты:
• Время кровотечения.
• Количество тромбоцитов.
• АЧТВ.
• Протромбиновое время (по Квику).
• Тромбиновое время и/или фибриноген.
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Для пациентов с тромботическими заболеваниями адекватного скрининга для диагностики нарушений системы гемостаза не разработано. Имеет смысл проведение исследования наиболее значимых маркеров тромбофилии, о которых будет говориться ниже. Однако есть возможность контроля активности самого процесса патологического тромбообразования на основе анализа концентрации маркеров тромбообразования.
Скрининговые тесты на состояние внутреннего и внешнего каскада активации протромбиназы позволяют выявлять нарушения со стороны факторов-субстратов, кофакторов, ингибиторов каскада свертывания, а также действие некоторых
лекарственных препаратов или аутоантител. Основным тестом на состояние внутреннего каскада свертывания плазмы является АЧТВ, на состояние внешнего каскада - ПВ. Их диагностическое значение представлено в табл. 17 и на рис. 94.
Несмотря на то что в тестах АЧТВ и ПВ участвует большинство плазменных факторов, далеко не во всех случаях при патологии того или иного звена или действии лекарственных препаратов эти показатели меняются (табл. 18). Коагу-лограмма - это комплексный анализ по многим тестам, совокупность которых может позволить определить конкретную причину нарушения свертывания крови.
Таблица 17
· Концентрация фибриногена начинает влиять на результаты тестов при снижении ее ниже определенного порога. Как правило, эти тесты не позволяют количественно определить фибриноген или заподозрить умеренное снижение его концентрации.
|
|
Рис. 94. Факторы, влияющие на результаты скрининговых тестов АЧТВ и ПВ. Звездочкой зависимые факторы, на которые влияют антикоагулянты непрямого действия
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Таблица 18
Изменение А ЧТВ и ПВ при патологии отдельных компонентов плазменного звена гемостаза
и влиянии некоторых лекарственных средств
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) |
В названии АЧТВ (иногда его обозначают как активированное парциальное тромбопластиновое время, АПТВ) слово «частичное», или «парциальное», указывает на то, что в тесте используются реагенты, содержащие фосфолипиды, а не тканевые факторы (в этом отличие от ПВ, где используется тканевой тромбопластин). Факторы и взаимные влияния некоторых из них на АЧТВ представлены на рис. 95.
АЧТВ используется как скрининговый тест для оценки внутреннего каскада свертывания плазмы, скрининговой диагностики волчаночного антикоагулянта и слежения за антикоагулянт-ным действием гепаринов. АЧТВ - более значимый тест для первичного выявления патологии,
чем ПВ, так как выявляет относительно часто встречающуюся гемофилию А и В (дефицит факторов VIII и IX соответственно) и наличие волчаночного антикоагулянта.