2015-07-03
1013
1. Определение кальция в сыворотке крови
| Оборудование: | 1. | Штатив с пробирками. |
| 2. | Пипетки на 0,1 мл, 1 мл и 5 мл. | |
| 3. | КФК. | |
| 4. | Кюветы на 0,5 см. |
| Реактивы: | 1. | Мурексидглицериновый реактив. |
| 2. | Дистиллированная вода. | |
| 3. | Сыворотка крови. |
Принцип метода. Кальций образует с мурексидом в щелочной среде окрашенный комплекс, концентрацию которого определяют колориметрически.
Ход работы. В пробирку вносят 0,3 мл воды, 0,1 мл сыворотки и 3 мл мурексидглицеринового реактива. Через 5 мин пробу колориметрируют в кювете толщиной 0,5 см при синем светофильтре (490 нм) против контроля, который готовят так же, как опытную пробу, внося в него вместо сыворотки 0,1 мл воды. Расчет содержания кальция проводят по калибровочному графику.
Нормальное содержания кальция в сыворотке крови у детей – 2,74-3,24 ммоль/л, у взрослых – 2,24–2,64 ммоль/л
2. Определение содержания кальция по реакции с комплексоном Арсеназо-III в сыворотке крови
| Оборудование: | 1. | Штатив с пробирками. |
| 2. | Пипетки на 0,1 мл и 5 мл. | |
| 3. | КФК. | |
| 4. | Кюветы на 0,5 см. | |
| Реактивы: | 1. | Рабочий реактив. |
| 2. | Стандартный раствор кальция (2,5 ммоль/л). | |
| 3. | Сыворотка крови. |
Принцип метода. Ионы кальция в кислой среде образуют с комплексоном Арсеназо-III комплекс синего цвета. Интенсивность окраски, пропорциональную содержанию кальция, определяют колориметрически.
|
|
|
Ход работы. В две пробирки вносят по 3 мл рабочего реактива (буферный раствор с Арсеназо-III). В одну пробирку (опытная проба) добавляют 0,1 мл сыворотки, во вторую пробирку (стандартная проба) – 0,1мл стандартного раствора кальция. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 2 минуты. Затем их колориметрируют при красном светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против рабочего реактива.
Расчет содержания кальция проводят по формуле:
С(ммоль/л) = ЕОП х CСТ/ ЕСТ
Нормальное содержания кальция в сыворотке крови у детей – 2,74-3,24 ммоль/л, у взрослых – 2,24–2,64 ммоль/л.
3. Определения неорганического фосфора в сыворотке крови
| Оборудование: | 1. | Штатив с пробирками. |
| 2. | Пипетки на 1 мл и 5 мл. | |
| 3. | КФК. | |
| 4. | Кюветы на 1,0 см. | |
| 5. | Центрифуга | |
| Реактивы: | 1. | 10% раствор ТХУ. |
| 2. | 5% раствор молибдата аммония. | |
| 3. | 1% раствор аскорбиновой кислоты. | |
| 4. | Дистиллированная вода. | |
| 5. | Сыворотка крови. |
Принцип метода. При взаимодействии неорганических фосфатов с молибдатом аммония образуется фосфомолибдат аммония, который восстанавливается аскорбиновой кислотой в окислы синего цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации фосфора.
|
|
|
Ход работы. Для осаждения белков в пробирку наливают 0,5 мл сыворотки, 2 мл дист. воды и 2,5 мл 10% ТХУ. Через 5 мин смесь центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. К 3 мл центрифугата добавляют 0,5 мл 5% раствора молибдата аммония и 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты. Пробу оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем колориметрируют при красном светофильтре в кювете толщиной 1 см против воды. Концентрацию фосфора определяют по калибровочному графику.
Норма содержания фосфора в сыворотке крови у детей – 1,29-2,26 ммоль/л, у взрослых – 0,64-1,29 ммоль/л.
Диагностическое значение определения кальция и неорганического фосфора в сыворотке крови
Гипокальциемия может быть при некоторых заболеваниях почек, особенно хронических; при гипофункции паращитовидной железы; у детей чаще всего встречается при рахите.
Гиперкальциемия бывает физиологическая и патологическая. Физиологическая может быть у новорожденных после четвертого дня жизни, у недоношенных детей, при избытке поступления кальция с пищей (алиментарная). Патологическая гиперкальциемия наблюдается при гиперфункции паращитовидной железы, гипервитаминозе Д, акромегалии, лейкозах, перитонитах, желтухе, аддисоновой болезни и гангрене.
Гипофосфатемия наблюдается при гиперпаратиреозе, гиперинсулинизме, остеомаляции, Д-авитаминозном рахите, гипосфатаземии.
Гиперфосфатемия наблюдается при гипопаратиреозе, акромегалии, гипервитаминозе Д, костных заболеваниях, заболеваниях почек, желтой атрофии печени, а также в периоды роста и при молочной диете.
Обмен кальция тесно связан с обменом фосфора. Изучение фосфорно-кальциевого обмена особенно важно у детей для своевременного выявления рахита и других нарушений формирования скелета. Гипокальциемия, вызванная недостаточностью витамина Д, сопровождается еще более выраженным снижением концентрации фосфора и повышением активности щелочной фосфатазы сыворотки.
4. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу 4-нитрофенилфосфата
| Оборудование: | 1. | Штатив с пробирками. |
| 2. | Пипетки на 0,1 мл и 5 мл. | |
| 3. | КФК. | |
| 4. | Кюветы на 0,5 см. | |
| Реактивы: | 1. | 20% раствор НСl. |
| 2. | Буфер рН 10,5. | |
| 3. | Субстрат (4-нитрофенилфосфат). | |
| 4. | Раствор ингибитора. | |
| 5. | Дистиллированная вода. | |
| 6. | Сыворотка крови. |
Принцип метода. Щелочная фосфатаза в буферном растворе расщепляет 4-нитрофенилфосфат на 4-нитрофенол и ортофосфат. Мерой активности фермента является количество освобожденного 4-нитрофенола, которое определяется колориметрически в щелочной среде.
Ход работы. В 2 пробирки наливают реактивы по схеме (см. таблицу). После добавления раствора ингибитора измеряют оптическую плотность опытной пробы (Е1) против контроля при фиолетовом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см. Затем в обе кюветы добавляют по 1 капле 20% раствора HCl и снова измеряют оптическую плотность (Е2) пробы против контроля.
| Реактивы (мл) | Опытная проба | Контроль |
| Раствор буфера рН 10,5 | 0,2 | 0,2 |
| Сыворотка | 0,02 | ---- |
| Дистиллированная вода | ---- | 0,02 |
| Обе пробирки прогревают 3 мин при 30ОС | ||
| Раствор субстрата (4-нитрофенилфосфат) | 0,05 | 0,05 |
| Обе пробирки инкубируют 15 мин при 30ОС | ||
| Раствор ингибитора | 2,0 | 2,0 |
Для расчета активности щелочной фосфатазы определяют разность оптических плотностей (Е1 - Е2) и с помощью калибровочного графика определяют соответствующую этой разности активность фермента. Активность выражают в международных единицах (Е/л), которые означают количество микромолей 4-нитрофенола, освобожденных 1 л сыворотки за 1 мин.
Норма активности щелочной фосфатазы у новорожденных – 50 -110 Е/л, у детей до 15 лет – 89 -180 Е/л, у взрослых – 38 - 85 Е/л.
|
|
|
5. Определение активности щелочной фосфатазы по фосфору.
| Оборудование: | 1. | Штатив с пробирками. |
| 2. | Пипетки на 1 мл и 5 мл. | |
| 3. | КФК. | |
| 4. | Кюветы на 1,0 см. | |
| Реактивы: | 1. | Глицерофосфатный буфер рН 8,6. |
| 2. | 10% ТХУ. | |
| 3. | 5% раствор молибдата аммония. | |
| 4. | 1% раствор аскорбиновой кислоты. | |
| 3. | Сыворотка крови. |
Принцип метода. Фосфатаза крови расщепляет b-глицерофосфат натрия с освобождением неорганического фосфора. Мерой активности фермента служит количество освободившегося фосфора.
Ход работы. В пробирку с 2,5 мл глицерофосфатного буфера рН 8,6 добавляют 0,5 мл сыворотки и помещают ее в термостат при 370С на 30 мин (опытная проба). В конце инкубации готовят контрольную пробу, в которой смешивают 2,5 мл буфера и 0,5 мл сыворотки. Затем в обе пробирки добавляют по 3 мл 10% раствора ТХУ и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Центрифугат осторожно сливают в чистые пробирки и добавляют к нему по 1 мл 5% раствора молибдата аммония и 1мл 1% раствора аскорбиновой кислоты. Через 15 мин колоримет-рируют опытную пробу против контроля при красном светофильтре в кювете толщиной 1 см.
Количество неорганического фосфора определяют по калибровочному графику.
Активность фосфатазы выражают в мг неорганического фосфора, образующегося под действием фермента в 100 мл сыворотки (единицы Боданского).
Для этого используют формулу: А=С х 200, где А – активность фосфатазы в единицах Боданского, С – концентрация фосфора, определенная по графику, 200 – коэффициент пересчета на 100 мл сыворотки.
Норма активности щелочной фосфатазы у детей – 5-15 единиц, у взрослых – 2-5 единиц.
Диагностическое значение определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови
Увеличение активности щелочной фосфатазы является одним из признаков рахита, причем степень гиперфосфатаземии зависит от тяжести заболевания. Значительное увеличение активности щелочной фосфатазы наблюдается при остеомаляции, при деформирующей остеодистрофии и при первичном гиперпаратиреоидизме. При механических желтухах активность фермента превышает нормальное значение в 5-10 раз; умеренная гиперфосфатаземия является одним из ранних признаков метастазов злокачественных новообразований. Резкая гиперфосфатаземия наблюдается при злокачественных костных новообразованиях остеобластического типа, но отсутствует при доброкачественных опухолях и новообразованиях остеолитического типа.
|
|
|
