Делеционное картирование

С. Бензер в 1955 г. использовал принципиально новый ме­тод картирования гена: из области количественного анализа он перевел его в качественный. Объектом послужила система ки­шечная палочка Е. coli— фаг Т4. Анализу был подвергнут ген r11 фага Т4. Фаг дикого типа (r+) на газоне Е. coli образует мелкие колонии, а мутант по гену rII — крупные (отсюда на­звание гена — rapid — быстроразмножающийся). Взаимоотно­шения системы бактерия — фаг можно представить схемати­чески (таб. 2).

Таблица 2.

Взаимоотно­шения системы бактерия — фаг.

Штаммы Е. coli	Генотип фагов Т4:
r+	rII
К-12 (λ)	+	_
B	+	++
S	+	+

Примечание. «+» - растет, колонии мелкие; «-» - не растет; «++» - растет, колонии крупные.

Из приведенной схемы видно, что штамм Е. coli К-12 (λ) можно использовать для отбора штаммов фага дикого типа, так как мутантные на нем не растут. Таким образом, если мутант­ный штамм фага Т4 будет расти на штамме К-12 (λ), то это могут быть или клетки с обратной мутацией rII к r⁺ (ревертанты) или рекомбинанты. Для изучения возможности реком­бинации внутри гена штамм К-12 (А) служит прекрасным се­лективным фактором. Проверить различие штаммов фага ди­кого типа и мутантного легко на штамме В Е. coli: оба растут, но колонии образуют разные. Для поддержания (размноже­ния) любых штаммов фага используют штамм Е. coliS,так как на нем растут любые штаммы фага.

С. Бензер получил 2000 мутантов фага Т4 по гену rII не­зависимого происхождения. Функциональный тест в этом слу­чае был бы практически невыполним: следовало бы проверить 2000*2000=4*10⁶ комбинаций. Но частичное его использова­ние показало, что есть мутанты, которые никогда не дают ре­комбинантных форм дикого типа, хотя мутанты, с помощью которых их тестировали, обнаруживали рекомбинации. Было сделано предположение, что формы, неспособные к рекомбина­ции, — это мутанты, у которых возникла делеция.

Для дока­зательства использовали методы денатурации — ренатурации ДНК и гибридизации ДНК двух штаммов, один из которых был дикого типа, а другой — с предполагаемой делецией. Если предположение верно, то после ренатурации должны образо­вываться гибридные молекулы ДНК, одна нить которой длин­нее другой на определенных участках (из-за делеций), а сле­довательно, должны образовываться петли. Таким способом были отобраны мутантные штаммы rII с делециями в разных участках гена, которые и послужили тестерами на дальнейших этапах анализа.

Рассмотрим делеционное картирование на конкретных примерах.

Задача. При совместном заражении двумя мутантами rII фага Т4 бактерий К-12 (λ) в одних комбинациях пятна лизиса образовывались, в других нет. Как объяснить подобные слу­чаи? Что можно сказать о генотипе мутантов rII фага Т4?

Это типичный пример комплементарного (функциональ­ного) теста Т. Моргана. Если два мутанта растут на штамме К-12 (λ), значит они дополняют друг друга и ведут себя как Т4-фаг штамма дикого типа. Они различаются тем, что у них мутировали два разных гена, при взаимодействии которых об­разуется фенотип дикого типа. Если при совместном зараже­нии двумя мутантами фаги не размножаются, значит это му­тации одного гена.

Общий вывод, который сделал С. Бензер на основании ре­зультатов этой части работы, состоял в том, что в локусе rIIсуществует два гена: А и В.

Задача. Использование фагов-мутантов с делециями в опре­деленном локусе и неизвестных мутантов для совместного за­ражения бактерий показало, что с фагом, имевшим одну из де­лений, не давали рекомбинации более ста мутантов, а с фагом, несущим другую делецию, лишь 2—5 мутантов из такого же числа исследованных. О чем это свидетельствует?

Это свидетельствует о неслучайности мутаций внутри гена. Участки, в которых возникает много мутаций, получили название «горячие точки».

Задача. В жидкую среду с бактериями Е. coli штамма В были внесены фаги Т4 двух мутантных штаммов rII, один из которых имел делецию. После некоторого периода совместного культивирования были взяты пробы фагов, которыми заража­ли Е. coli штаммов В и К-12 (λ). Оказалось, что на культу­рах бактерий штамма В число образовавшихся пятен лизиса значительно больше, чем на газоне штамма К-12 (Я). Чем мож­но объяснить эти факты?

Тот факт, что на штамме Е. coli К-12 (λ) фаги размножа­лись, свидетельствует о том, что эти фаги дикого типа. Они могли возникнуть только в результате рекомбинации между мутантными фагами, а так как рекомбинации происходят не очень часто, число пятен лизиса на газоне штамма К-12 (λ) было значительно меньше, чем на газоне штамма В, на кото­ром размножаются любые фаги, в том числе и мутантные. Этот эксперимент показал также, что между двумя изученными му­тантами процесс рекомбинации шел с образованием фагов ди­кого типа, следовательно, тестируемая мутация была вне зо­ны делеции (рис. 1).

Рис.1. Делеционное картирование.

Задача. При совместном заражении двумя мутантными фа­гами число пятен лизиса на газоне бактерий Е. coli штамма К-12 (λ) в одном случае в два раза больше, чем в другом (другое сочетание двух мутантов), однако при таком же зара­жении было одинаковое количество колоний на газоне штам­ма S. Что можно сказать об анализируемых мутантах?

Чем больше появилось колоний фага на штамме К-12 (λ), а они могли быть только дикого типа, тем чаще имела место рекомбинация между ДНК разных фагов, следовательно, мож­но заключить, что в первом случае частота рекомбинации была выше, чем во втором. На газоне штамма S растут любые фа­ги, поэтому количество колоний и было одинаковым в обоих случаях.

Задача. При совместном заражении двумя мутантными фа­гами штаМма Е. coli В и при последующем пересеве фагов на газон штамма Е. coli К-12 (λ) на последнем не было ни одного пятна. О чем это может свидетельствовать?

Отсутствие размножения фага на штамме Е. coli К-12 (λ) свидетельствует о мутантности фагов. Можно предположить, что между ДНК мутантов не было рекомбинаций, а следова­тельно, не образовались фаги дикого типа. Это возможно, если один из мутантов или оба имели делеции по гену rII.

5. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ В ИЗУЧЕНИИ ГЕНОВ

При изучении структуры генов методы гибридологического анализа должны сочетаться с методами молекулярной генети­ки, только в этом случае могут быть плодотворные результаты. Примером успешного использования такого рода комбиниро­ванных приемов может служить открытие мозаичного строения генов эукариот.

Сравнение структуры ДНК, соответствующей ей иРНК и синтезированного на их основе полипептида, показало, что они не точно соответствуют друг другу. Отсюда появилось пред­ставление о процессинге и сплайсинге иРНК, с одной стороны, и экзонно-интронном строении гена, с другой. Основные мето­ды, которые были при этом использованы, это -секвенирование и молекулярная гибридизация.

5. 1. Выделение и клонирование генов. Банки генов

Впервые ген в пробирке был получен путем химического синтеза, но на практике удобнее оказалось выделять гены из генома. Для этого использовали метод трансдукции гена фага­ми у бактерий. Так, с помощью фага % был выделен ген лактозного оперона Е. coli. Получают гены и путем обратной тран­скрипции (кДНК), но наиболее широкое распространение полу­чил рестрикционный метод. Синтезированный или выделенный ген встраивают в плазмиды или другие векторы, которые в бак­терии или дрожжевой клетке могут размножиться и тем самым дать начало клону генов. Из таких клонов ДНК составляются банки (библиотеки) генов, которые широко используются в дальнейшем для решения различных задач. Созданы банки ге­нов для рРНК, тРНК и других генов таких объектов, как дро­зофила, Xenopusи многие другие. Создается банк генов чело­века.

Если ДНК идентифицирована, то ее используют в качестве зонда для картирования генов на цитологическом препарате для установления числа одноименных генов в генотипе (повто­ряющаяся ДНК), для локализации их в хромосомах. Затем можно проводить сравнительно-эволюционный анализ стабиль­ности молекул ДНК и решать другие вопросы.

5.2. Рестрикционое картирование

Для картирования генов используют различные рестриктазы - ферменты, которые распознают чужую ДНК и вызывают ее деградацию путем разрезания молекулы. При этом каждый фермент узнает вполне определенную небольшую, из четырех или шести нуклеотидов, последовательность, как правило, пред­ставленную палиндромом. В результате образуются тупые (рестриктаза Нае III) или, чаще, липкие концы (рестриктаза Eco RI и др.). Липкие концы, которые возникают вследствие того, что в разных нитях ДНК разрезы несколько смещены от­носительно друг друга, очень удобны для гибридизации фраг­ментов ДНК разных организмов, но полученных путем обра­ботки одной и той же рестриктазой. Благодаря тому, что из­вестно уже более 500 разных рестриктаз, возможности полу­чения фрагментов ДНК практически очень велики. Таким методом получают отдельные гены, которые используются для са­мых разнообразных целей генной инженерии, и в том числе для изучения структуры и функции самого гена, его локали­зации.

При использовании рестриктаз очень часто обнаруживают полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов в клетках разных индивидов одного вида, который обусловлен различиями нуклеотидного состава одноименных хромосом. Это свой­ство ДНК может быть использовано при решении многих про­блем генанализа. Так, например, с помощью этого метода можно определить, какому родителю принадлежит Х-хромосома у индивидов Х0, и ответить на вопрос о возможности пре­имущественного образования гамет без X-хромосом у того или другого родителя.

Рестрикционный анализ успешно используется для картиро­вания делений, которые затем служат тестерами при изучении структуры генов. Карты хромосом, составленные на основе ре­зультатов рестрикционного анализа, называют физическими картами.

5.3. Методы секвенирования

Методы определения нуклеотидного состава молекулы ДНК или ее определенного фрагмента - гена - получили название секвенирования. Секвенирование ДНК играет большую роль в химическом синтезе генов, способствует изучению их функции, во многом облегчает исследование мобильных генетических элементов генома.

Методы определения аминокислотной последовательности в пептидах или белках также носят название секвенирования. Примером практического использования результатов секвениро­вания в изучении структуры и функции гена может служить ген, кодирующий гормон роста млекопитающих соматостатин. Работа началась с определения первичного строения поли­пептида, состоящего из 14 аминокислот. На базе результатов, полученных путем секвенирования, был химически синтезиро­ван ген соматостатина из 584 пар нуклеотидов, встроен в плаз­миду, которой трансформировали Е. coli. Благодаря тому, что ген был поставлен под контроль промотора триптофанового оперона, в клетках Е. coli синтезировался гормон роста человека. На основе секвенирования ДНК хромосом составляют химические карты.

6. Методы выявления генных мутаций

Сложность выявления генных мутаций связана, во-первых, с рецессивностью большинства мутаций (вероятность их фенотипического проявления ничтожно мала), а во вторых с летальностью многих из них (мутанты не выживают).

Все множество методов выявления генных мутаций можно разделить на две группы: методы генетического анализа и биохимические методы.