На адсорбцию ферментов на носителе

Протекание процесса адсорбции и прочность связывания фер­мента с носителем в значительной степени зависят от условий проведения иммобилизации. Основными факторами, влияющими на адсорбцию фермента» являются удельная поверхность и по­ристость носителя, значения рН и ионной силы раствора фер­мента, его концентрация и температура проведения процесса адсорбции.

Удельная поверхность и пористость носителя. Сорбционная емкость носителя пропорциональна его удельной поверхно­сти. В приложении к белкам (ферментам) эта закономерность, однако, действует только в том случае, когда носитель непорис­тый или когда диаметр пор намного превосходит размер бел­ковых молекул. Если же поры настолько малы, что не могут вместить молекулу фермента, то для белка оказывается доступ­ной только часть общей поверхности, т. е. сорбционнан ем­кость носителя по отношению к ферменту небольшая, несмотря на очень большую общую удельную поверхность. Критерий для определения оптимального размера пор носителя для адсорбци­онной иммобилизации ферментов был предложен Р. Мессингом (1976), который изучал адсорбцию различных ферментов на по­ристом стекле и керамических носителях с калиброванным размером пор. В соответствии с этим критерием диаметр пор должен приблизительно в два раза превосходить размер мо­лекулы белка в направлении ее максимального удлинения- При этом предполагается, что молекулярные размеры субстрата на­много меньше, чем фермента, так что молекула субстрата за­ведомо способна проникнуть в пору, где находится сорбнрован-

ный фермент. В том случае, если субстратом является вещество с очень большой молекулярной массой, выбор диаметра пор носителя может диктоваться уже размерами молекулы субстрата. Более того, высокомолекулярный субстрат сам может служить носителем для иммобилизации фермента. Например, для адсорб­ционной иммобилизации ферментов целлюлазного комплекса был успешно использован его субстрат — целлюлоза.

Значение рН. Реакция среды оказывает очень сильное влия­ние на эффективность сорбции фермента на поверхности носи­теля, особенно, если сорбция осуществляется главным образом за счет электростатических нааимодейстннй. Причина этого влияния состоит в том, что при изменении рН меняется состоя­ние ионизации ионогенных групп носителя и белка, ответствен­ных за связывание. Прн использовании носителей, не являю­щихся ионообмеЕшиками, максимальная адсорбция обычно дости­гается в нзоэлектрнческой точке белка. Иными словами, рН-за­висимость адсорбции должна иметь вид кривой с одним макси­мумом, соответствующим значению изоэлектрической точки. Од­нако известны случаи, когда это правило нарушается. Напри* мер, рН-зависнмость эффективности адсорбции альбумина на ла­тексе имеет вид W-образной кривой, а значение рН, при кото­ром достигается максимальная адсорбция этого белка на угле, изменяется от 3 до 6 в зависимости от типа последнего.

Ионная сила. Значение этой величины оказывает влияние
на прочность связывания фермента с носителем. При высокой
концентрации солей присутствующие в растворе ионы вытесняют
с поверхности носителя связанные за счет электростатических
взаимодействий белковые молекулы. Иными словами» возраста­
ние конной силы вызывает десорбцию фермента. Однако иногда
эта закономерность не действует, и увеличение концентрации
соли, наоборот, способствует адсорбции фермента на носителе.
В таких случаях принято говорить об эффекте «высаливания»
белка из раствора. ч-

Коицентрация фермента. При возрастании концентрации фермента в растворе, из которого происходит адсорбция, коли­чество сорбировавшегося на носителе фермента увеличивается и соответственно растет удельная каталитическая активность иммобилизованного препарата. Зависимость удельной каталити­ческой активности от исходной концентрации фермента, как пра­вило, имеет вид кривой с насыщением, что свидетельствует о существовании лишь ограниченного числа центров связывания фермента и а поверхности носителя, которые к тому же обла­дают неодинаковым сродством по отношению к белку. При дальнейшем повышении концентрации фермента в растворе мо­жет происходить образонание поверх первого слоя адсорбиро­ванного фермента второго и последующих слоев- Наибольшей каталитической активностью обладают верхние слои адсорбиро­ванного фермента, где ограничения, накладываемые на скорость реакции диффузией субстрата, минимальны. Поэтому излишняя

ггрузка» носителя ферментом приводит к тому, что более глубоко расположенные слои адсорбированного биокатализатора исключаются из сферы реакции, и в результате общая эффек­тивность использования фермента снижается.

Температура. Повышение температуры оказывает двоякое воздействие на процесс адсорбционной иммобилизации. С одной стороны, сильное нагревание приводит к потере ферментативной активности вследствие тепловой денатурации белковой глобулы. С другой стороны, рост температуры обычно обеспечивает уско­рение процесса благодаря повышению скорости диффузии мо­лекул фермента в порах носителя. Следовательно, должна су­ществовать некоторая оптимальная температура для проведе­ния адсорбционной иммобилизации. Точное значение оптималь­ной температуры зависит от природы адсорбируемого фермента и поверхности носителя.

Таким образом, эффективность адсорбционной иммобилиза­ции ферментов определяется тонким балансом целого ряда фак­торов. Нарушение этого баланса вследствие изменения (порой незначительного) какого-либо из внешних условий может при­вести к резкому ослаблению взаимодействия фермента с носи­телем и, следовательно, к его десорбции. Чтобы избежать этого нежелательного явления, на практике используется ряд методи­ческих приемов, некоторые «з которых рассмотрены в следую­щем разделе.

§ 5. Способы увеличения эффективности связывания фермента с носителем

Иммобилизация на предварительно модифицированных но­сителях. Предварительная модификация носителя во многих случаях позволяет существенно повысить прочность связывания адсорбционно-иммобилнзонанного фермента. Следует подчерк­нуть, что помимо увеличения эффективности сорбции модифика­ция носителя нередко обеспечивает также улучшение каталитиче­ских свойств иммобилизованного фермента благодаря созданию для его молекул благоприятного микроокружения. Более того, без предварительной модификации носителя иногда вообще не удается сохранить каталитическую активность фермента при ад­сорбционной иммобилизации. Например, если фермент обладает низкой стабильностью в кислой области рН, то при его адсорб­ции на силикагеле может произойти потеря каталитической активности, поскольку поверхность этого носителя имеет кислый характер (рН —4), Для предотвращения инактивации фермента силикагель перед проведением иммобилизации необходимо вы­держать некоторое время в буферном растворе с таким значе­нием рН, которое является оптимальным для данного фермента. Аналогичная проблема часто возникает при адсорбционной им­мобилизации ферментов, которым для нормального функциони­рования необходимо присутствие в активном центре иона ме-

талла. Дело в том, что большинство носителей способны селек­тивно и прочно сорбировать ионы металлов, поэтому при ад­сорбционной иммобилизации металлозависимых ферментов мо­жет происходить частичная или полная потеря каталитической активности, обусловленная выходом иона металла из активного центра фермента и его связыванием на поверхности носителя, Это нежелательное явление можно устранить, если до прове­дения иммобилизации обработать носитель избытком раствора, содержащего ионы соответствующего металла, и тем самым на­сытить центры сорбции ионов металла на носителе.

Предварительная обработка носителя ионами металлов при­меняется также и для повышения прочности связывания ад-сорбционно-иммобилиэованных ферментов. Увеличение эффек­тивности сорбции достигается в этом случае за счет образо вакия комплекса белка с ионами переходных металлов (таких, как Ti, Sn, Zr, V_t Fe)_t которые,в свою очередь, прочно связаны с поверхностью носителя (рис. 4,а). Иными словами, ион метал­ла выступает в роли мостика, соединяющего молекулу фермента с носителем. Этот метод дает хорошие результаты при иммоби­лизации различных ферментов на таких носителях, как, на­пример, целлюлоза, найлон, стекло, фильтровальная бумага и т. д.

Способ, основанный на обработке носителя ионами металлов, может служить хорошей иллк>страцией одного из главных прин­ципов, лежащих в основе применения модифицированных носи­телей: модификация должна придавать носителю такие свойства, благодаря которым усиливается его способность к связыванию ферм с нтон.

Один из возможных путей достижения этой цели состоит, помимо использования ионов металлов, в обработке носителя веществами, молекулы которых содержат большое число функ­циональных групп, способных взаимодействовать с группами на поверхности ферментной глобулы за счет электростатических и водородных связен (рис. 4,6). Например, полимеризация на поверхности силохрома акриловой кислоты, винилацетата и т. п. с последующей химической модификацией полимера приводит к образованию носителя, характеризующегося высокой поверхност­ной концентрацией функциональных групп (гндроксильных, амииоалкильных, аминоарильных и гидразидных). В качестве модификатора часто используется также альбумин, который на­носится на носитель путем адсорбции, а затем подвергается денатурации нагреванием. Слой денатурированного альбумина образует на поверх ногти носителя «мягкую» подложку с боль­шим числом функциональных групп, способную прочно связы­вать молекулы фермента, одновременно обеспечивая для них благоприятное микроокружение. В результате во многих случаях при обработке альбумином удается добиться повышения эффек­тивности сорбции и улучшения каталитических характеристик иммобилизованного фермента.

заряженная

гидрофобная нотка

гидрофильный фврмвкт

гидрофобный ферменг

Рис. 4. Адсорбционная иммобилизация ферментов на предвари­тельно модифицированных носителях

Для повышения эффективности сорбции может быть также использована модификация носителя гидрофобными соединения­ми. Связывание фермента с такими носителями обеспечивается за счет гидрофобных взаимодействий между модификатором и неполярными участками на поверхности белковой глобулы. При этом способе иммобилизации применяются те же носители, которые используются при гидрофобной хроматографии белков. В первую очередь к ним относятся различные а га розы _т ковал ент-ио модифицированные гидрофобными группами (алкильными, феннльными и т. п.). На конце такой гидрофобной «ножки» мо жег присутствовать также и заряженная группа _t благодаря чему обеспечивается взаимодействие с ферментом одновременно за счет электростатических и гидрофобных сил (рис. 4, в). При таком «многоточечном» связывании сорбция многих ферментов протекает практически необратимо. Эффект много­точечного связывания достигается также при использовании полисахаридных носителей, модифицированных танином — при­родным дубящим веществом, содержащим большое число фе-нольных групп. Танин может быть либо адсорбирован на носи­теле, либо связан с ним химически. Удерживание фермента на

поверхности обработанных танином носителей обеспечивается за счет электростатических, водородных в гидрофобных взаимодей­ствий.

Эффективность сорбции фермента может быть увеличена также при использовании носителей, предварительно модифици­рованных путем адсорбции монослоя липида (см. гл. 1). Ис­пользуя носители с той или иной ориентацией липидных моле­кул в адсорбированном монослое, можно добиться максималь­ной эффективности сорбции как гидрофильных (рис. 4,г), так и гидрофобных (рис. 4_fd) ферментов.

Модификацию носителя иногда проводят путем ковалентной пришивки к его поверхности молекул, ннляющихся- специфиче­скими лигандами иммобилизуемого фермента. Иммобилизация с использованием таких носителей достигается за счет образо­вания прочного нековалентного комплекса между ферментом и связанным с носителем лнгандом. Этот метод иммобилизации, получивший название аффинной сорбции, широко используется в лабораторной практике, например, для избирательного выде­ления ферментов из сложных смесей (аффинная хроматогра­фия).

Рис. 5. Адсорбционная иммобилизация предварительно модифицирован и ы\ ферментов

Иммобилизация предварительно модифицированных фермен­тов. При адсорбционной иммобилизации на ионообменниках час­то возникают затруднения, связанные с тем, что для многих ферментов изоэлектрическая точка и рН-оптимум каталитиче­ской активности очень близки. Поэтому прочная сорбция наб­людается лишь в областях рН, далеких от изоэлектри-ческой точки, где каталити­ческая активность мала. Что­бы преодолеть это препят­ствие, был разработан ме­тод иммобилизации фер­ментов, предварительно мо­дифицированных введением ионогенных групп {полн-кислоты, карбокснметилцел­люлоза, остатки янтарной кислоты и т.п,). Например, при модификации а-химо-трипсина хлортриазинолым красителем (активным ярко-оранжевым КХ) изоэлек­трическая гочка фермента сдвигается в щелочную об­ласть. В результате этого модифицированный а-хнмо-трипсин достаточно хорошо сорбируется на многих ионо-обменннках с сохранением

каталитической активности. Другой пример - модификация аосимотрипсина растворимой карбоксн метил целлюлозой* в ре­зультате которой он приобретает способность прочно свя­зываться с ДЭАЭ-целлюлоэой и ДЭАЭ-сефадексом при ней­тральных значениях рН. Принцип, лежащий в основе этого способа иммобилизации» иллюстрируется схематическим рис. 5, а.

При иммобилизации на гидрофобных носителях эффектив­ность связывания можно увеличить, если промодифицировать молекулу фермента гидрофобными группами (рис. 5,6).

Другие способы увеличения прочности связывания фермента с носителем. Для предотвращения смывания иммобилизованного фермента с носителя часто используют прием, при котором слой адсорбированного фермента обрабатывают бифункциональным сшивающим агентом. В результате на поверхности носителя образуется как бы сплошная пленка из сшитых между собой молекул фермента. В качестве сшивающего агента чаще всего применяется глутаровый альдегид.

Оригинальный способ, позволяющий существенно повысить количество сорбционно иммобилизованного фермента был предложен К-Мартине ком с сотр. (1976), которые использо­вали для иммобилизации найлоновые волокна, подвергнутые частичной химической деструкции. Волокна помещают в раствор фермента (рис. 6, а) и подвергают механическому растяжению,

растягивающее усилие

Рнс. 6. Иммобилизаций ферментов путем механического за­хвата в порах иэнлоновой нити при ее растяжении

в результате чего размер пор на их поверхности увеличивается. Молекулы фермента получают благодаря этому возможность проникнуть внутрь пор к там адсорбироваться (рис. 6, б). Через некоторое время растягивающее усилие снимают, волокно сжимается и размер пор возвращается к исходному значению. При этом молекулы фермента, оказавшиеся внутри пор при растяжении волокна, уже не могут покинуть их. Иными словами, происходит механический захват молекул фермента порами носителя (рис. 6, е).

Сравнительно новым методом является электроудерживание, при котором иммобилизация ферментов, осуществляется под действием электрического поля на коллекторах, отделенных от электродов мембранами. 8 качестве коллектора могут исполь­зоваться силикагель, ноиообменники, минералы н другие носи­тели. Фермент удерживается на коллекторе за счет электро­статических и диполь-дипольных взаимодействий между поляри­зованными частицами коллектора и молекулами белка. Недостаток этого метода состоит в том, что система должна постоянно находиться под напряжением, поскольку в противном случае фермент будет смываться с носителя.