Мембраны

2 cosh of -- I

.каж

Таким образом, роль внутриднффузионных ограннчений в кине­тике реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами, сводится к увеличению кажущейся константы Мкхаэлнса.

При выводе уравнений для рассмотренных систем делалось допущение, что частицы носителя с иммобилизованным ферментом представляют собой плоские мембраны. Однако в общем случае форма частиц может быть иной — сферической, цилиндрической, неправильной. Решение задачи в случае частиц носителя произ­вольной формы приводит к следующему выражению для на блюда- 106

емои скорости фермента­
тивной реакции, контро­
лируемой диффузией:
у_иай1 = ijt»_T где v — ско­
рость реакции в отсутст­
вие диффузионных огра­
ничений; tj — фактор эф- °'⁶
фективности, который за­
висит от параметра Ф_%
называемого модулем Ти­
ле- Хотя конкретный вид
функции ц {Ф) зависит
от формы частицы и по­
рядка реакции по суб­
страту, но очень часто
описывается кривой, ана­
логичной виду зависи­
мости F от Ы (рис. 17).
Таким образом параметр

J, характеризующий внутреннюю диффузию в плоской мембра­не, является частным случаем модуля Тиле. Для оценки роли внутренней диффузии в конкретной системе с иммобилизованным ферментом в принципе необходимо вычислить модуль Тиле Ф к, ос­новываясь на рис. 17, сравнить соответствующее значение ц с еди­ницей.

Способы различия внутридиффузионных и внешнедиффузион-ных ограничений. Существует два основных экспериментальных критерия, по которым можно определить, протекает ли реакция, ка­тализируемая иммобилизованным ферментом, во внутридиффу-зиоином или внешнедиффузнонном режиме. Онн основаны на раз­личной чувствительности кинетических параметров ферментатив­ных процессов, контролируемых внешней и внутренней диффузией субстрата, к действию специфических лнгандов и температуры. Для внутриднффузионно-контролируемых реакций прн очень больших значениях а/, когда F <С 1, т. е. ферментативная реакция существенно замедлена диффузией, имеем /См, каж Э> [S]o- В этом случае для общей скорости ферментативной реакции, отнесенной к объему носителя, справедливо выражение

Видно, что скорость реакции пропорциональна квадратному корню из концентрации фермента и его активности (k_Kb1l). Эта ситуация существенно отличается от случая внешнедиффузионных ограни-чений, когда скорость реакции в диффузионной области не зависит от каталитических свойств фермента. В частности, ферментатив­ные реакции, контролируемые внутренней диффузией, «чувствуют» эффекты ингибирования, рН-завнсимость активности и т. п.

Как было отмечено выше, температурные зависимости реакций.

контролируемых внешнедиффузионными ограничениями, целиком определяются чувствительностью к температуре коэффициента диффузии D (энергии активации порядка 15—20 кДж/моль). Иная ситуация реализуется для процессов, контролируемых внут-ридиффузнонными ограничениями. Здесь кажущееся значение энергии акт ивации за висит от температурного хода как кинетиче­ского (/Л^т/Км.клж) и диффузионного параметров, так и коэффи­циента распределения Р субстрата между раствором и фазой носи­теля [уравнение (12)1 ^и> ^ка«правило, характеризуется более вы­сокими численными значениями (больше 40 кДж/моль).

Стерические ограничения в катализе иммобилизованными фер­ментами. Пространственная сетка матрицы, в которой иммоби­лизован фермент, может препятствовать продвижению молекул субстрата, например, в силу чисто механических причин. В резуль­тате активные центры части ферментных молекул оказываются недоступными для субстрата. Фактически это означает снижение концентрации активного фермента и приводит к уменьшению наблюдаемой скорости ферментативной реакции. Следовательно, хотя истинные каталитические параметры и не изменились, фер­мент не может полностью проявить свою потенциальную актив­ность.

Уменьшение каталитической активности фермента за счет сте-рическнх факторов проявляется особенно часто в случае высоко­молекулярных субстратов. Поэтому при создании биокатализато­ров» действующих на белки» нуклеиновые кислоты и другие природ­ные биополимеры, предпочтительнее иммобилизовать ферменты на водорастворимых носителях с небольшой молекулярной массой. Стерическне ограничения иногда удается уменьшить или даже полностью устранить путем деградации носителей под действием химических реагентов (мягкой обработкой окислителями, кисло­тами н т. п.) или специальными ферментами {декстраназой, цел-люлазой н др.). При этом важно, чтобы такая обработка не затро­нула первичную структуру и ие нарушила пространственную орга­низацию ферментов, пришитых к носителю.

рН-Эффекты в катализе иммобилизованными ферментами. Из ферментативной кинетики хорошо известно, что скорости реак­ций с участием ферментов в гомогенном растворе сильно зависят от значения рН. Это обусловлено тем, что в катализе участвуют функ­циональные группы белка, способные протонироваться или депро-тонироваться в зависимости от рН в растворе, а реакционноспо-собной является» как правило, только одна из форм.

В принципе рН-эффекты в катализе иммобилизованными фер­ментами описываются теми же закономерностями, которые были рассмотрены при анализе распределения субстрата. Однако ионы Н"¹" и ОН"~ относятся к числу наиболее обших эффекторов ферментативной активности, поэтому вопрос о влиянии их рас­пределения и диффузии на кинетику действия гетерогенных биокатализаторов необходимо рассмотреть отдельно.

1. Распределение протонов- В качестве примера рассмотрим

6

ТО рН

Рис.!8. Гипотетические рН-зависимости каталити­ческой активности свободного (ней н мобилизован­ного) фермента (кривая 2), иммобилизованного из поликатионном (кривая J), полианионном (кри­вая 3) носителях

фермент, иммобилизованный на гшлиэлектролнтном носителе. Пусть для определенности оптимум действия фермента в гомо­генном растворе наблюдается при рН 8, а кривая зависимости ак­тивности от рН имеет колоколообразный вид (кривая 2 на рис. 18). Если для работы с иммобилизованным ферментом значение рН во внешнем растворе выбрать равным 8, то из-за эффекта распре­деления протонов внутри полиэлектролитной матрицы оно будет другим. Так» если фермент иммобилизован на полнанионном носи­теле, то внутри него концентрация протонов выше, чем во внешием растворе (сдвиг в сторону более кислых значений рН); обратная картина имеет место в случае поликатионного носителя. Это при­ведет к тому, что фермент» иммобилизованный как на поликатнон-ном (кривая / на рис. 18)_т так н на лолианионном (кривая 3 на рис. 18) носителе, будет работать не с полной эффективностью, хотя значение рН во внешнем растворе соответствуюет оптимуму его каталитической активности.

Подобные изменения рН~зависимостн ферментативной актив­ности часто наблюдаются в реальных системах. Они целиком обу­словлены присутствием на полиэлектролитном носителе заряжен­ных групп. Добавление в систему с иммобилизованным ферментом высококонцентрированных растворов солей или буферных систем вызывает экранирование зарядов групп носителя и, следователь­но, уменьшение сдвигов рНчэптимумов активности. Иными слова­ми, сдвиг рН-зависимостей активности иммобилизованных фер­ментов, обусловленный распределением протонов, наблюдается только в разбавленных буферных растворах с низкой ионной си-лой. С другой стороны, зависимость сдвига рН-оптимума актив­ности от ионной силы служит серьезным указанием на то, что распределение протонов между раствором и носителем играет

важную роль в катализе иммобилизованным препаратом фер­мента,

2. Ограничение диффузии протонов. Полимерный носитель, на котором иммобилизован фермент, может препятствовать свобод­ной диффузии протонов внутри частицы носителя. Это связано с тем, что внутри частицы носителя существенно заторможена диффузий протонов по механизму, характерному для гомоген­ного раствора. Поскольку концентрация протонов в системе обычно мала (10~⁷ моль/л или ниже), то даже небольшой избы­ток (или, наоборот, дефицит), обусловленный торможением диф­фузии, может вызвать заметное изменение рН внутри частицы. Это, в свою очередь, приведет к существенному изменению рН-зави си мости каталитической активности, особенно для т,ех фер­ментативных реакций, и которых протоны являются субстратом или продуктом (как₍ например, при действии гидролаз, дегндро-геназ, киназ и некоторых других ферментов).

Пусть, например, фермент, иммобилизованный на носителе, катализирует реакцию» сопровождающуюся образованием про­тонов, в отсутствие буферного раствора. После начала реакции в матрице начинают накапливаться протоны, что приводит к по­явлению градиента концентрации протонов и последующей их диффузии ня частицы во внешний раствор. Однако если диффу­зия заторможена, то протоны накапливаются внутри частицы и вызывают уменьшение рН в микроокружении фермента. Это, в свою очередь, влияет на скорость ферментативной реакции, а значит, и на скорость выделения протонов — продукта фермента­тивной реакции. Если рН внутри частицы до начала реакции вы­ше рН-оптимума фермента, то образующиеся в ходе реакции протоны снижают рН, повышая тем самым скорость фермента­тивной реакции, т. е. скорость выделения протонов. В результате значение рН частицы уменьшается еще сильнее, а скорость фер­ментативной реакции еще больше нозрастает. Иными словами, в такой системе будет наблюдаться явление автокатализа. Окон­чательно стационарное состояние будет достигнуто только тогда, когда значительное повышение концентрации протонов будет оказывать лишь незначительное влияние на скорость фермента-тивной реакции*.

Если значение рН начала реакции ниже рН-оптимума актив­ности, то по мере выделения протонов в ходе ферментативной реакции рН уменьшается еще сильнее и реакция замедляется. На графике рН-зависимости относительной ферментативной ак­тивности (рис. 19) это отразится следующим образом: ветви кри­вой, соответствующие низким значениям рН для иммобилизован­ного и нативного ферментов, практически совпадут, а «щелоч­ная» ветвь кривой (выше рН-оптимума активности) в случае иммобилизованного фермента существенно расширится (сравни

ВОЗМОЖНЫ CHiy*JH,HH, КО) Да CTdtUHHltipilOe СОСТОЯНИС |1С ДОСТИГАЕТСЯ

I¹ itum случае нзблкмикпия ko.il-б:ш" i- i процессы; и инк p"'ii т*йяп нщку НО

кривые 1 и 2). причем до та- Аит»«стк% кой степени, что может пре- юо вратиться ь плато (кри­вая 3). В предельном слу­чае, когда иммобилизован­ный фермент работает при рН ниже значения рН опти­мальной активности, рН-за­висимость активности может трансформироваться к виду (кривая 4), т. е. с достиже­нием плато. Чем существен­нее диффузионные ограниче­ния протонов в носителе и чем выше активность иммо­билизованного фермента, тем ниже будет высота плато на кривой 4. Если в ходе реак­ции происходит поглощение протонов, то будут наблю­даться обратные явления.

Таким образом, если в экслериме нте н аб л юд аютс я рН-зависимостн активности, аналогичные тем, что приве­дены на рис. 19_t то это ука­зывает на ограничения диф­фузии протонов в системе с иммобилизованным ферментом.

Ускорение диффузии протонов в присутствии буферных растворов. Если система с иммобилизованным ферментом {по­добная той, что была описана в конце предыдущего раздела)

Рис 20. Схематическое изображение процесса пере­носа притонов компонентами буферного раствора в системе с иммобилизованным ферментом

Рис. 21. Влияние буферной системы, ускоряющей перенос протонов в си­стеме с иммобилизованным ферментом, ни вид рН-зависимости его каталитиче­ской активности

Кривая 1 — свободный (не и м мобилизован­ный) фермент в растворе; крннпя 2 -нымобилнзр ванный фермент при значи­тельных ограничения¹; в диффузии прото­нов: кривые 3 и 4 — иммобилизованный ферм«кт по мере снятий ограничении % диффузии протонов увеличивающимися концентрациями буферного раствора

работает в присутствии компо­нентов буферного раствора, то они, связывая образующиеся в ходе реакции протоны, могут переносить их, удалять из мик­роокружения фермента. Обу­словлено это тем, что на гра­нице раздела частица носителя/ /раствор создается градиент концентрации протонироваиной формы основной компоненты буферного раствора (ВН⁺). Это приведет к диффузии фор­мы ВН⁺ в свободный раствор, где за счет более высокого значения рН она продиссоци-ирует с высвобождением сво­бодной формы В, которая, в свою очередь, будет диффунди­ровать по градиенту концент­рации в частицу носителя (см. рис. 20). В системе, где свободная диффузи» протонов сильно ограничена (кривая 2 на рис. 21), добавление буфер­ного раствора может привести к смещению плато в сторону более высоких значении актив­ности и к появлению S-образ-ного характера у

ветви рН-зависимости (см. кривые 3, 4 на рис.

Таким образом, добавление буферных растворов в систему с иммобилизованным ферментом может «снимать» ограничения в диффузии протонов и приводить к увеличению ферментативной активности в области некоторых значений рН.

Сочетание эффектов распределения и диффузии протонов. Если в системе с иммобилизованным ферментом одновременно имеют место эффекты распределения протонов и ограничения их диффузии, то заранее трудно предсказать вид рН-зависи-мостн активности. Оба этих фактора могут действовать взаимо­согласованно: либо как синергисты (т.е. усиливать друг друга), либо как антагонисты (ослаблять действие друг друга). Возмож­но несколько различных вариантов: фермент иммобилизован на полианионном, поликатионном или нейтральном носителе, и катализируемая им реакция протекает с выделением или поглоще­нием протонов, либо вообше не сопровождается изменением их кон­центрации. Здесь не будут рассмотрены все эти возможные ва­рианты. Отметим, что только дли фермента, иммобилизованного на электронейтральном носителе и катализирующего процесс,

не сопровождающийся изменением концентрации протонов, не должно наблюдаться изменений рН-зависимости активности. Но даже в такой системе вид кривой зависимости активности фермента от рН может измениться, если лимитирующей стадией реакции является диффузия субстрата.

Эффекты ингибированкя и активации в катализе иммобили­зованными ферментами. Полимерный носитель может вносить свою специфику и в действие таких регуляторов ферментативной активности, как ингибиторы и активаторы.

Низкомолекулярные ингибиторы и активаторы. Влияние и из ко -молекуляриого ингибитора на фермент определяется, в основном, распределением молекул ингибитора между фазой носителя и раствором. Диффузионные ограничения, как правило, не изме­няют характер ингибирования фермента после достижения ста­ционарного СОСТОЯНИЙ.

Наиболее прост для анализа тот случай, когда носитель не накладывает ограничения на диффузию субстрата и характер ингибирования целиком определяется распределением субстрата и ингибитора между матрицей и раствором. Если ингибитор и полимерный носитель одноименно заряжены, то степень ингибирования снижается {по сравнению с ситуацией в гомо­генном растворе), а если они несут на себе заряды противо­положного знака, то степень ингибирования возрастает. Если в последнем случае субстрат имеет одинаковый заряд с носи­телем, то степень ингибирования еще более увеличивается. В данном изложении не будут рассмотрены конкретные примеры: случаи конкурентного и неконкурентного ннгибирования, ингиби­рования продуктом реакции и т. п. Читатель ножет это проделать сам в качестве упражнения и вывести соответствующие матема­тические выражения. Анализ этих систем показывает, что во всех случаях кинетика действия иммобилизованных ферментов, осложненная ингибированием, описывается уравнением Миха-элнеа — Ментен.

Несколько более сложную задачу представляет описание ингибирования при наличии диффузионных ограничений для субстрата. Можно показать, что при очень сильном ограничении диффузии субстрата иммобилизованный фермент может вообще не реагировать на добавление ингибитора, и скорость реакции определяется скоростью диффузии субстрата. При достаточно высоких концентрэцих субстрата процесс может перейти в кине­тическую область и присутствие ингибитора становится заметным. Если же диффузия субстрата ограничена незначительно, то ингибитор будет подавлять активность иммобилизованного фер­мента. В промежуточных случаях степень ингибировання фермен­та постепенно снижается по мере того, как повышается уровень ограничений в диффузии субстрата.

Высокомолекулярные ингибиторы. Активность некоторых нто15 in vivo, в первую очередь протеаз, регулируется ингибиторами белковой природы с молекулярными массами

около 10 000 и выше. Естественно, их действие на иммобилизо­ванные ферменты может осложняться как диффузионными огра­ничениями, так и стерическими затруднениями. Оба этих эф­фекта будут препятствовать контакту молекулы ингибитора с ферментом и тем самым уменьшать эффективность ингибиро-взния.