Этот путь, однако, дает слишком приближенные оценки, поэтому им относительно редко пользуются на практике. Чаще используют экспериментальные критерии. Рассмотрим основные из них

Зависимость скорости ферментативной ре­акции от концентрации субстрата. Как уже отме­чалось, в условиях насыщения иммобилизованного фермента субстратом, т. е. при достаточно высоких его концентрациях, ферментативный процесс, в принципе, не может контролиро­вался диффузией субстрата, и. следовательно, реакция проте­кает в кинетической области. Однако по мере уменьшения концентрации субстрата повышается вероятность перехода реак­ционной системы в диффузионную область. Поэтому по экспе­риментальной зависимости и от S в координатах Лайнуивера — Берка (рис. 15) наблюдается четко выраженный излом: при концентрациях субстрата выше значения в точке излома (т. е. при низких значениях 1/[5]) реакция проходит в кинетическом режиме— прямая /, а при низких концентрациях субстрата (вы­соких значениях 1/[ S\) в диффузионном режиме—прямая 2. Таким

юз

образом, если для иммоби­лизованного фермента в координатах Ланнуиве-ра — Берка получена за­висимость, аналогичная представленной на рис. 15, это является существен­ным указанием на то, что диффузия играет в процес­се важную роль.

Температурные зависимости. Фер­ментативные реакции ха­рактеризуются обычно энергиями активации по­рядка 40—120 кДж/моль. В то же время скорость процессов, протекающих в диффузионной области, должна слабо зависеть от температуры; поскольку

единственный чувствительный к температуре параметр D ха­рактеризуется энергией активации порядка 15—20 кДж/моль. Следовательно, слабая зависимость скорости реакции, катали­зируемой иммобилизованным ферментом, от температуры может служить указанием на то, что процесс протекает в диффузион­ном режиме. Однако с повышением температуры реакция мо­жет переходить из кинетической области в диффузионную, поскольку Э и VfKm в уравнении (7) по-разному зависят от температуры.

Зависимость скорости реакции от удель­ной концентрации иммобилизованного фер­мента (количества активного фермента на I г носителя). Как видно из анализа уравнения (7), скорость реакции в диффузион­ной области не должна изменяться при возрастании удельной концентрации иммобилизованного фермента. Кроме того, ско­рость диффузионно-контролируемых реакций не должна также зависеть от таких факторов, как изменение рН, ионной силы, добавление ингибиторов и активаторов, которые оказывают спе­цифическое влияние исключительно на ферментативные стадии (что легко проследить в случае натнвного фермента). Следует, однако, учитывать, что для одного и того же препарата иммоби­лизованного фермента реакция со специфическим (высокореак-ционнеспособным) субстратом может быть диффузионно контро­лируемой, а с неспецифическим субстратом (менее реакционно-способным) протекать в кинетической области.

Зависимость скорости реакции от степени измельчения частиц с иммобилизованным ферментом. Скорость реакции в кинетической области не

должна зависеть от степени измельчения частиц, содержащих катализатор (если, конечно, нет внутридиффузионных затрудне­ний для субстрата, см. ниже). С другой стороны, скорость диф-фузнонно-контролируемых реакций будет возрастать по мере уменьшения размера частиц с иммобилизованным ферментом, по­скольку такое уменьшение приводит к увеличению диффузионно­го параметра р в уравнении (7).

Зависимость от скорости перемешивания. Влияние диффузионных факторов ослабляется по мере ускорения массопереноса путем более интенсивного перемешивания. Этот вывод становится особенно очевидным, если встать на позиции представлений о неперемешиваемом слое (слое Нернста) как о физической реальности» для которой применим первый закон Фика. Из гидродинамики следует, что толщина неперемеши-ваемого слоя уменьшается при увеличении скорости потока жид­кости вокруг частицы. Таким образом, зависимость наблюдаемой скорости ферментативной реакции от скорости перемешивания или скорости протока субстрата указывает на существенную роль диффузии в процессе. Увеличение скорости протока субстрата через колоночный реактор и повышение числа оборотов мешалки в реакторе перемешивания должно ослабить диффузионные огра­ничения. Существенное ускорение перемешивания может, в прин­ципе, перевести реакцию из диффузионной области в кинетическую.

Внутридиффузионное торможение. Реакция, катализируемая ферментом, иммобилизованным внутри частицы (например, включенным в полимерный гель), может оказаться чувствитель­ной к торможению за счет внутренней диффузии. Иными слова­ми, скорость ферментативной реакции может лимитироваться скоростью проникновения субстрата внутрь частицы. Внутридиф­фузионное торможение ферментативных реакций зависит от фор­мы частицы с иммобилизованным ферментом.

Рассмотрим следующую модель. Имеется плоская мембрана толщиной /, содержащая иммобилизованный фермент с концен­трацией в мембране [£]. Мембрана погружена в раствор субстра­та, концентрация которого равна [5]. Коэффициент распределе­ния субстрата между раствором и мембраной равен Я. Требуется найти зависимость между скоростью появления продукта в растворе и кинетическими параметрами (к_кат и Кн. «**) фермен­тативной реакции.