Зависимость ферментативной активности от концентрации

субстрата определяется дву­мя взаимосвязанными фак­торами: степенью диффузи­онных ограничений субстрата и его концентрацией в сво­бодном растворе. При этом- чем выше концентрация суб­страта н чъм ниже исходная активность фермента, тем больше вероятность, что ферментативная реакция будет протекать в кинетиче­ском режиме. Поэтому по­нятно, что увеличение кон­центрации субстрата, сопро­вождаемое снижением фер­ментативной активности {за счет ннгибнровання фермен­та), может вызвать резкий переход реакции им диффу­зионного режима в кинети­ческий.

Рассмотрим этот вывод подробнее. Согласно перво­му закону Фика скорость переноса субстрата к фер­менту прямо пропорциональ­на концентрации субстрата у поверхности носителя. Ка­тализируемая иммобилизо­ванным ферментом реакция ' достигает стационарного со­стояния, когда скорость переноса субстрата к ферменту стано­вится равной скорости его ферментативной трансформации. На рис. 22 стационарные состояния задаются точками пересечения кривой зависимости ферментативной активности от концентра­ции субстрата с прямой скорости диффузии субстрата к фер­менту. При высоких скоростях диффузии, т. е. незначительных диффузионных ограничениях (прямая 1), так и при низких ско­ростях диффузии, т. е. весьма больших диффузионных ограни­чениях {прямая 3), ня рис. 22 наблюдается лишь одна точка пересечения — одно стационарное состояние. При промежуточ­ных скоростях диффузии (прямая 2) имеется три точки Пересе-чения, т.е. допустимы три различных стационарных состояния. Если построить график зависимости реальной скорости фермен­тативной реакции от концентрации субстрата, то при высоких и низких значениях концентрации субстрата возможно только одно стационарное состояние, а при промежуточных значениях — три состояния: А, В и С. Таким образом, получаем гистерезисную

]\5

кривую (рис. 23), Она означает, что скорость ферментативной реакции определяется не только концентрацией субстрата во внешнем растворе, но и зависит от направ­ления изменения концент­рации субстрата. Так, при повышении концентрации субстрата во внешнем растворе скорость фер­ментативной реакции уве­личивается. Однако при достижении некоторой критической концентрации субстрата система перехо­дит из диффузионной об­ласти в кинетическую и скорость реакции суще-ственно падает {рис. 23). При понижении концен­трации субстрата скорость реакции остается низкой до тех пор пока не произойдет обратный переход из кинетической области в диффузионную. При дальнейшем уменьшении концентра­ции субстрата скорость ферментативной реакции снова нач­нет падать.

Причины того же характера приводят к появлению внутри-мембранных колебательных процессов. В качестве одного из примеров приведем катализируемый папаином, иммобилизован­ным в искусственной мембране, гидролиз этилового эфира 1^-бензойл-и-аргинина. Один нз продуктов ферментативной реак­ции — аминокислота, накапливается в мембране (за счет ограни­чения диффузии) и тем самым с-двигает рН внутри мембраны п сто­рону более кислых значений. Это неизбежно уменьшает гидролити­ческую активность лапаина, так как фермент «выходит» из своего рН-оптимума активности. В дальнейшем за счет более быстрой диф­фузии Н⁺ по сравнению с ОЬГвозрастает значение рН внутри мем­браны и активность лапаина снова увеличивается. Таким образом, был получен микрореактор с периодом колебания 20 с. Изменением концентрации фермента в мембране, толщины мембраны и дру­гих параметров системы удается варьировать продолжитель­ность одного колебания.

Анализ условий, при которых могут наблюдаться гистерезис-иые и колебательные явления, показал, что для их возникновения необходимо» чтобы, во-первых, на зависимости скорости фермен­тативной peaк г inи от концентрации субстрата имелся максимум или точка перегиба, т, е, фермент активируется или ингибируется