Концентрации субстрата

При высокой концентрации субстрата – скорость максимальна

Константа Михаэлиса (К_мих) – концентрация субстрата, при которой скорость реакции = ½ (половина) скорости максимальной.

К_мих отражает сродствофермента и субстрата (К_мих маленькая => сродствовыше)

Каждый фермент имеет свою К_мих.

К_мих характеризует каталитическую активность фермента => чем меньше К_мих, тем активнее фермент.

19. Регуляция активности ферментов в клетке Регуляция активности ферментов

Быстрая	Медленная (на уровне: включение/выключение генов)
Изменение рН, температуры	Изменение скорости биосинтеза белка-фермента

Типы регуляции:

· Ковалентная модификация

· Аллостерическая регуляция

Уровни регуляции:

1. Свойства окружающей среды

2. Аллостерическая регуляция

3. Изменение активности синтеза

4. Влияние гормонов на ферментативный аппарат клетки

5. Методы количественного определения ферментов. Единицы активности ферментов Для определения ферментативной активности используют следующие методы: 1. Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (О-гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров). 2. Спектрофотометрический метод (прибор испускает пучок света через раствор, проходя через раствор, пучок света изменяется) – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при характеристической длине волны (лиазы – по образованию двойной связи). 3. Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.). 4. Флюрометрический (каждое вещество испускает свой спектр излучения) 5. Газометрический метод (Манометрический)– определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О2, декарбоксилазы – по выделению СО2). 6. Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза). Единицы измерения активности ферментов: 1. Стандартная международная единица (юнит) – количество фермента, которое превращает 1 микромоль субстрата в 1 минуту 2. Катал – количество фермента 1 моль субстрата в 1секунду 3. Молярная активность – количество молекул субстрата, превращаемых 1 моль фермента за 1 минуту (число оборотов) 4. Удельная активность – молярная активность / (разделить на) масса белка 6. Применение ферментов в медицине. Энзимотерапия Энзимотерапия – лечение ферментами Виды:

Заместительная -использование ферментов в случае их недостаточности (не хватает фермента => можно добавить)

Патогенетическая - применение ферментов в сочетании с другой терапией

· эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков Например, пепсин используют при ахилии, гипо- и анацидных гастритах. · Дефицит панкреатических ферментов может быть компенсирован приёмом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезим-форте и др.)

Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин): для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей Гиалуронидаза: для рассасывания коллоидных рубцов, спаек Ряд ферментов для лечения опухолей (аспарагиназа для лечения лейкозов) Коллагеназа ДНК-аза: лечение вирусных заболеваний глаз Препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы: при тромбозах и тромбоэмболиях

7. Энзимодиагностика Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы основаны на следующих позициях: · при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток; · количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения; · активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений; · ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность); · существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов. Причины, приводящие к увеличению количества ферментов в крови Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы:

Первая (небольшая группа)	Вторая (большая группа)
ферменты активно секретируется в плазму крови определёнными органами	ферментов, высвобождающихся из клеток во время их нормального функционирования. ферменты выполняют свою функцию внутри клетки и не имеют физиологического значения в плазме крови
Например, печень синтезирует неактивные предшественники ферментов свёртывающей системы крови	У здорового человека активность этих ферментов в плазме низкая и достаточно постоянная, так как постоянно соотношение скоростей высвобождения их из клеток и скоростей разрушения.

При многих заболеваниях происходит повреждение клеток, и их содержимое, в том числе и ферменты, высвобождаются в кровь.

К причинам, вызывающим высвобождение внутриклеточного содержимого в кровь, относят нарушение проницаемости мембраны клеток (при воспалительных процессах) или нарушение целостности клеток (при некрозе).

Уровень активности ферментов в плазме коррелирует со степенью повреждения клеток.

Для энзимодиагностики имеют большое значение знания о субклеточной локализации ферментов.

воспалительный процесс	глубокие повреждениях клетки, некроз
появление в плазме крови ферментов, имеющих только цитозольную локализацию	при обнаружении митохондриальных или ядерных ферментов

Изоферменты - ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белк.

Они катализируют один и тот же тип реакции с принципиально одинаковым механизмом, но отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента.

Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты. Следовательно, изоферменты различаются по первичной структуре белковой молекулы и, соответственно, по физико-химическим свойствам. На различиях в физико-химических свойствах основаны методы определения изоферментов.

По своей структуре изоферменты в основном являются олигомерными белками. Причём та или иная ткань преимущественно синтезирует определённые виды протомеров. В результате определённой комбинации этих протомеров формируются ферменты с различной структурой - изомерные формы. Обнаружение определённых изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.

Изоформы лактатдегидрогеназы.

Фермент лак-татдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты)

ЛДГ (лактатдигидрогеназа) - олигомерный белок, состоящий из 4 субъединиц 2 типов

Типы: Н – сердце (heart), М – мышца (muscle)

Лактат	ЛДГ 1 – утилизация	ЛДГ 5 катализирует образование
В сердце и почках	ЛДГ 1 (т.к. аэробный обмен пируват быстро окисляется до СО2 и Н2О)	ЛДГ 2
В мышцах и печени	ЛДГ 5 (т.к. глюкозный обмен пируват восстанавливается до молочной кислоты)	ЛДГ 4
В крови (в норме)	ЛДГ 2
В крови (при паталогии)	ЛДГ 1 – при инфаркте миокарда	ЛДГ 5 и ЛДГ 4 – при гепатите