2015-09-06
753
Тема: Будова мікроскопу і правила користування ним. Види мікроскопії. Приготування препаратів для мікроскопії. Прості та складні методи зафарблення
Мета: ознайомитися з особливостями роботи в мікробіологічній лабораторії; вивчити типи сучасних мікроскопів, освоїти способи мікроскопії, правила роботи з імерсійною системою; підготувати препарати живих і фіксованих пофарбованих клітин мікроорганізмів.
Матеріали й устаткування: природні субстрати (кисляк, кефір, настій сіна, біогумусу, розсіл квашеної капусти, цвіль та ін.) і постійні препарати з культур мікроорганізмів (Streptococcus lactis, Streptomyces recifensis, Staphylococcus aureus, Saccharomyces cereviceae, Lactobacterium plantarum, Bacillus subtilis та ін.), мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки на 1–2 мл, бактеріологічні петлі, пінцети, тонкі предметні й покривні скельця, у тому числі з лункою, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, розчини метиленового синього (1:40), фуксину основного, генціанвіолета, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, дистильована вода.
Теоретичні положення
Для вивчення морфології мікроорганізмів у прохідному світлі використовують оптичні мікроскопи МБР (рис. 1.1), МБД.
Механічна частина складається зі штатива з предметним столиком, тубуса, револьвера, механізму наведення різкості, що складається з макрометричного й мікрометричного гвинтів.
Оптична частина мікроскопа включає об'єктив і окуляр. Об'єктив є найважливішою частиною мікроскопа.
Він складається із системи лінз, укладених у металеву оправу. Одне з позначень на оправі відповідає значенню збільшення об'єктива. В мікроскопі МБР використовуються об'єктиви, що дають збільшення в 8, 40 і 90 разів. Збільшення об'єктива залежить від фокусної відстані головної – фронтальної лінзи. Чим більше кривизна фронтальної лінзи, тим коротше фокусна відстань, тобто тим нижче треба опускати об'єктив над площиною препарату. Інші лінзи називаються корекційними, вони необхідні для усунення сферичної й хроматичної аберації. Окуляр містить дві лінзи – очну (верхню) і збірну (нижню). Окуляри можуть давати збільшення в 5, 7, 10, 12, 15 і 20 разів, що зазначено на їхній оправі.
Освітлювальна система включає дзеркало з двома поверхнями (увігнутою та плоскою) і конденсора (у мікроскопі МБД є убудоване джерело світла). Увігнуте дзеркало збирає й концентрує в площині препарату пучок рівнобіжних променів світла, що йдуть від джерела
Рис. 1.1. Мікроскоп МБР-1:
1 – основа мікроскопа; 2 – предметний столик; 3 – гвинти для переміщення предметного столику; 4 – клеми для фіксації препарату; 5 – конденсор; 6 – кронштейн конденсора; 7 – гвинт, що закріплює конденсор у гільзі; 8 – гвинт переміщення конденсора; 9 – ручка ірисової діафрагми конденсора; 10 – дзеркало; 11 – тубусоутримувач; 12 – макрометричний гвинт (кремальєра); 13 – мікрометричний гвинт; 14 – револьвер; 15 – об’єктиви; 16 –тубус; 17 –гвинт для кріплення тубуса; 18 – окуляр.
світла, тому їм користаються в тих випадках, коли працюють без конденсора, тобто з малим збільшенням. Конденсор, укріплений безпосередньо над дзеркалом, складається з двох лінз і призначений для збирання паралельних променів світла, відбитих дзеркалом, у крапці-фокусі, що знаходиться в площині препарату. Убудована в конденсор ірисова діафрагма служить для затримання зайвих променів світла і дозволяє при необхідності зменшувати апертуру конденсора.
Загальне збільшення, що дає мікроскоп, визначається добутком збільшення об'єктива на збільшення окуляра. Виразність одержуваного зображення характеризується дозвільною здатністю, що визначається мінімальною відстанню між двома крапками, коли вони ще не зливаються в одну.
Величина дозвільної здатності мікроскопа залежить від довжини хвилі використовуваного світла (l) і суми числових апертур об'єктива (A1) і конденсора (A2):
(1. 1)
Числова апертура визначається добутком синуса половини кута охоплення лінзи та показника заломлення середовища (n), що граничить із лінзою: A = sin U·n. Тобто числова апертура характеризується кількістю променів, що попадають у лінзу (рис. 1.2).
Дозвільна здатність мікроскопа – величина, зворотна дозвільної відстані. Чим більше дозвільна здатність, тим меншої величини об'єкт можна побачити. Світловий мікроскоп за умов використання видимого світла має дозвільну здатність близько 0,2 мкм.
 |
Рис 1.2. Схема ходу променів із різною величиною отвірного кута:
А – об’єкт;
О – об’єктив;
a – отвірний кут;
U – половина отвірного кута.
Підвищити дозвільну здатність можна двома шляхами: висвітлюючи об'єкт більш короткими променями світла, наприклад, УФ, або, збільшуючи показник середовища, що граничить із лінзою, для того, щоб наблизити його до показника заломлення скла (n скла = 1,5). У вивченні мікроорганізмів майже постійно користаються імерсійним, або олієзануреним об'єктивом (90х), що дає збільшення у 900–1350 разів (рис. 1.3). Тому всі промені, не переломлюючись і не змінюючи свого напрямку, потрапляють в об'єктив і забезпечують гарну видимість дрібних об'єктів.
Мікроскопія в темному полі
Для дослідження об'єктів малої величини використовують темнопольну мікроскопію. Для цього в біологічному мікроскопі звичайний конденсор заміняють спеціальним конденсором темного поля, що має затемнену середню частину і пропускає тільки бічні промені.
Рис 1.3. Вплив імерсійної олії на хід променів у мікроскопі:
1 – об’єктив;
2 – предметне скло;
3 – об’єкт;
4 – імерсійна олія;
5 – промені світла;
6 – фронтальна лінза об’єктива.
Таким чином, мікроскопія в темному полі заснована на висвітленні об'єкта косими променями світла. Ці промені, не потрапляючи в об'єктив, залишаються невидимими для ока, тому поле зору виглядає зовсім чорним (рис. 1.4).
 |
Рис. 1.4. Схема ходу променів у конденсорі темного поля:
1 – лінза конденсора;
2 – чорна пластинка;
3 – об’єктив.
Якщо препарат містить якісь частки, наприклад, мікроорганізми, то косі промені, проходячи через такий препарат, у значній мірі відбиваються від поверхні цих часток і, ухиляючись від свого первісного напрямку, попадають в об'єктив. Тоді спостерігач бачить на чорному фоні інтенсивно світні об'єкти з різким бічним контрастом. При цьому апертура конденсора повинна бути трохи більше апертури об'єктива (об'єктив необхідно діафрагмувати, а конденсор імергувати).
Фазово-контрастна мікроскопія
Більшість препаратів живих мікроорганізмів слабо контрастні, тобто клітини мало відрізняються за забарвленням і прозорості від навколишнього середовища. Проте світлова хвиля набуває певних змін: проходячи через ділянки препарату, що мають більший, ніж у навколишнього середовища показник заломлення, вона виходить із деяким відставанням за фазою. Спеціальний фазово-контрастний пристрій дозволяє оптичним шляхом перетворювати розходження за фазою в зміни амплітуди, у результаті чого живі прозорі об'єкти стають контрастними, їх можна побачити оком.
Оптична система, яка використовується для одержання фазового контрасту, складається з фазової пластинки в одній з лінз об'єктива, що має форму кільця, і кільцевої діафрагми в спеціальному конденсорному пристрої. Для одержання фазового ефекту необхідно точне сполучення фазового кільця з проекцією кільцевої діафрагми (рис. 1.5).
 |
Рис. 1.5. Схема ходу промінів із використанням фазово-контрастного пристрою:
1 – кільцева діафрагма;
2 – конденсор;
3 – об’єкт;
4 – об’єктив;
5 – фазова пластинка.
Порядок виконання роботи
1. Ознайомитися з правилами поведінки й техніки безпеки в мікробіологічній лабораторії.
2. Ознайомитися з правилами роботи з чистими культурами мікроорганізмів (додаток 1) та методами їхньої мікроскопії.
3. Приготувати й провести мікроскопічне дослідження прижиттєвих препаратів мікроорганізмів.
Метод “роздавленої краплі”
На чисте знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять краплю суспензії мікроорганізмів. Якщо в культурі розвилося дуже багато бактерій, її розводять водою.
Покривне скло ставлять на ребро з краю краплі і поступово опускають на неї. Між стеклами не повинно залишатися пухирців повітря, які заважатимуть мікроскопії. Крапля повинна бути невеликою, щоб після “роздавлення” рідина не виступала за край покривного скла. Препарат розглядають із сухою системою.
Метод “висячої краплі”
Препарат “висяча крапля” використовують для виявлення рухливості мікроорганізмів. Крім того, можна довгостроково спостерігати за життєдіяльністю мікроорганізмів: розмноженням, утворенням і проростанням спор.
Для готування препарату невелику краплю суспензії мікроорганізмів наносять на покривне скло, перевертають його краплею вниз і поміщають на спеціальне предметне скло з поглибленням (лункою) у центрі. Крапля повинна вільно висіти, не торкаючись країв і дна лунки. Край лунки попередньо змазують вазеліном. Крапля виявляється герметично замкненою у вологій камері, що дозволяє багатоденне спостерігання за об'єктом.
Препарати розглядають під мікроскопом, злегка затемнюючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. З невеликим збільшенням знаходять край краплі, що буде чітко видний у затемненому полі зору. Край краплі пересувають у центр поля зору мікроскопа і переводять на велике збільшення, розширивши при цьому діафрагму. Більш чіткі результати можна одержати у мікроскопії у темному полі чи у фазовому контрасті.
Препарат “відбиток”
Ці препарати є зручними для вивчення природного розташування кліток у колонії мікроорганізмів й особливо для дослідження форми спор і спороносців актиноміцетів і грибів.
З агаризованої пластинки, на якій мікроорганізми виросли суцільним газоном, вирізають скальпелем невеликий блок і переносять на предметне скло так, щоб поверхня з мікроорганізмами була звернена нагору. Потім до газону прикладають чисте покривне скло і негайно знімають, намагаючись не зрушити убік. Отриманий препарат поміщають відбитком униз у краплю води (можна в краплю метиленового синього) на предметне скло і розглядають під мікроскопом із сухою системою. Такий відбиток можна одержати і на предметному склі, якщо торкнутися ним поверхні колонії. Відбитки можна фіксувати й забарвлювати будь-яким способом.
4. Приготувати для мікроскопічного дослідження препарати фіксованих і забарвлених клітин мікроорганізмів простим способом.
Дослідження фіксованих забарвленихпрепаратів – найбільш розповсюджений мікробіологічний метод для виявлення морфологічних особливостей, кількісного обліку мікроорганізмів, а також для перевірки чистоти культури. Фіксовані забарвлені препарати можуть зберігатися тривалий час і розглядаються з імерсійною системою. Їхнє готування включає наступні етапи: виконання мазка, висушування, фіксацію й забарвлення. У простому забарвленні мікроорганізмів застосовують якийсь один з основних анілінових барвників: метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий. Профарбовується вся клітина.
Готування мазка
За допомогою стерильної бактеріологічної петлі чи піпетки нанести на знежирене предметне скло краплю суспензії мікроорганізму.
Матеріал із густого живильного середовища узяти бактеріологічною петлею, внести його в краплю стерильної водопровідної води та рівномірно тонким шаром розподілити на площі 1–2 см2.
Висушування мазка
Висушити приготовлений мазок при кімнатній температурі у повітрі. Тонкий мазок висихає дуже швидко. Якщо висушування мазка уповільнене, препарат можна злегка нагріти в струмені теплого повітря, тримаючи предметне скло високо над полум'ям пальника мазком нагору. Цю операцію проводять дуже обережно, не перегріваючи мазка, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.
Фіксація
Фіксація переслідує кілька цілей: забезпечити прикріплення клітин до скла; зробити мазок більш сприйнятливим до забарвлення, оскільки мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі; зробити безпечним подальші маніпуляції з мазком, що важливо в роботі з патогенними мікроорганізмами. Найпростіший і розповсюджений спосіб фіксації – термічна обробка. Після висушування мазок зафіксувати в полум'ї пальника. Тримаючи скло мазком нагору, тричі провести його через гарячу частину полум'я пальника. Щоб уникнути перегріву, час прямого впливу полум'я не повинний перевищувати 3–4 с. Крім жару фіксацію можна робити хімічними речовинами, для цього використовують 96 %-ний етиловий спирт (час фіксації 5–10 хвилин), суміш Нікіфорова (спирт: ефір – 1:1; час фіксації 10–15 хвилин); ацетон (5 хвилин) та ін.
Забарвлення
Фіксований препарат помістити мазком нагору на місток із двох паралельних скляних паличок, з'єднаних гумовими трубками, що знаходяться на стінках кювети чи кристалізатора. Нанести на нього 2–3 краплі барвника (кінець піпетки не повинний торкатися мазка!) на 2–3 хвилини. Під час фарбування розчин барвника на мазку не повинний підсихати, при необхідності доливати нові порції. Для одержання більш чистих препаратів барвник наливають на мазок, покритий фільтрувальним папером. По закінченні фарбування препарат промивають водою доти, поки стікаюча вода не стане безбарвною. Потім препарат висушують у повітрі і промокають фільтрувальним папером.
5. Виконати мікроскопію з імерсією фіксованого та забарвленого препарату мікроорганізму.
Правила роботи з імерсійним об'єктивом.
Після установлення освітлення приготовлений сухий пофарбований препарат спочатку розглядають із невеликим збільшенням під об'єктивом сухої системи (8х, 40х). Знайшовши найбільш удале місце на ньому, препарат закріплюють затисками на столику мікроскопа. Тубус мікроскопа піднімають і, повертаючи револьвер, установлюють імерсійний об'єктив. Потім у центр препарату на мазок, не знімаючи зі столика мікроскопа, наносять краплю імерсійної (кедрової) олії і, дивлячись збоку, обережно опускають тубус мікроскопа до занурення об'єктива в олію. Стежать за тим, щоб фронтальна лінза не торкнулася предметного скла і не одержала ушкодження. Після цього, дивлячись в окуляр, макрометричним гвинтом повільно піднімають об'єктив до появи в полі зору досліджуваного об'єкта. Фокус уточнюють за допомогою мікрометричного гвинта.
Після роботи кедрову олію негайно видаляють з об'єктива серветкою, що змочена очищеним бензином. Ксилол і спирт використовувати не рекомендується, тому що вони можуть викликати розклеювання лінз об'єктивів.
У правильно забарвленому і добре промитому препараті поле зору залишається світлим і чистим, а пофарбованими залишаються клітини мікроорганізмів.
6. Вивчити препарати. Результати занести до протоколу у вигляді малюнків. Зробити висновки.
7. Препарати, перш ніж вимити, поміщають у судину з дезінфікуючим розчином.
Лабораторна робота № 2
Тема: Морфологія та класифікація бактерій і грибів
Мета: вивчити морфологічну різноманітність прокаріотичних і еукаріотичних організмів.
Матеріали й устаткування: природні субстрати (кисляк, кефір, настій сіна, біогумусу, розсіл квашеної капусти, гниле м'ясо й ін.) і постійні препарати з культур мікроорганізмів різних морфологічних груп (Streptococcus lactis, Micrococcus lisodeikticus, Lactobacillus acidophylum, Streptomyces recifensis, Staphylococcus aureus, Lactobacterium plantarum, Bacillus subtilis і ін.), добові культури дріжджових грибів, що вирощені на чашках Петрі (Candida tropicalis, Saccharomyces cereviceae), 5–7 добові культури цвілевих грибів (Mucor mucedo, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillum cyclopium, Blakeslea trispora, Oidium lactis), мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки на 1–2 мл, бактеріологічна петля, пінцет, препарувальна голка, тонкі предметні стекла, покривні скельця, у тому числі з лункою, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами: метиленовий синій (1:40), водний розчин фуксину основного, генціанвіолет, стерильний розчин чорної туші (1:9); імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованої водою.
