Теоретичні положення

Бактерії складають найбільш велику і дуже різноманітну групу (понад 1600 видів) мікроорганізмів. Бактерії – це в основному одноклітинні організми, що розмножуються простим поперечним поділом. Морфологічно бактерії розрізняють за формою, взаємним розташуванням клітин, наявністю чи відсутністю джгутиків і капсул, здатністю клітин до спороутворення і т.п.

За формою бактерії поділяються на кілька груп: сферичні, циліндричні, спіральні, незвичайної форми і нитчасті.

Кулясті (сферичні) бактерії – коки (Coccus). Напрямок площини поділу клітин і характер взаємного розташування клітин використовують як систематичну ознаку для виділення родів сферичних бактерій. Діаметр коків 0,5–1,2 мкм.

Моно- чи мікрококи (рід Micrococcus). Їхні клітини поділяються в будь-якій площині і відразу після поділу відокремлюються, розташовуючись поодиноко.

Диплококи (рід Diplococcus) і стрептококи (рід Streptococcus) утворюються у поділі клітин в одній площині; у диплококів клітини розташовуються попарно.

Стрептококи (рід Streptococcus) поділяються також в одній площині, але клітини не відокремлюються одна від одної, а утворюють ланцюжка.

Тетракоки (рід Tetracoccus) виникають за умов поділу клітин у двох взаємно перпендикулярних площинах, клітини утворюють групи по 4 особини.

Сарцини (рід Sarcina) формуються у розподілі клітин у трьох взаємно перпендикулярних площинах, при цьому утворюються пакети з 8–12 клітин і більш.

Стафілококи (рід Staphylococcus) представляють скупчення клітин, що нагадують виноградні грона. Поділ клітин відбувається в будь-якій площині.

Крім правильної кулястої форми, клітини можуть мати овальну чи ланцетоподібну форму (пневмококи), чи бобоподібну форму кавового зерна (гонококи, менінгококи).

Кулясті бактерії, як правило, не мають джгутиків, нерухомі і спор не утворюють.

Паличкоподібні (циліндричні) бактерії – найчисленніша та різноманітніша група бактерій. Паличкоподібні бактерії розрізняють по величині кліток, їхньому розташуванню, обрису кінців клітини, по наявності чи відсутності джгутиків. Довжина клітин паличкоподібних бактерій коливається від десятих часток мкм до 10–15 мкм і більш, діаметр клітин від 0,5 до 1,0 мкм.

Більшість паличкоподібних мікроорганізмів – форми безспорові, вони називаються бактеріями (Bacterium, позначають Bact., чи B). Паличкоподібні бактерії, які здатні за несприятливих умов формувати спори, прийнято називати бацилами (Bacillus, позначають Bac.). Бактерії й бацили розташовуються поодиноко, чи попарно з'єднуються в ланцюжки, в останньому випадку їх називають відповідно стрептобактерії та стрептобацили. Спори різних бактерій відрізняються за формою, розмірам і положенню в клітині. За умов бацилярного положення спори локалізуються в клітині у центрі, ексцентрально чи термінально і при цьому клітина не змінює свою форму. Під час клостридіального формування спори клітина змінює форму, здобуваючи вид човника чи веретена. Ендоспора розташовується в стовщеній частині клітини центрально чи ексцентрально. Плектридіальне положення – це термінальна локалізація спори. У місці її розташування клітина розширюється й здобуває вид барабанної палички чи ракетки. Клостридіальний і плектридіальний типи розташування ендоспор властиві в основному видам роду Clostridium і нерідко зустрічаються в культурі одного виду цього роду.

Звиті (спіральні) бактерії у залежності від форми й кількості витків поділяють на три типи клітин.

Вібріони (рід Vibrio) представлені короткими вигнутими паличками у формі коми. Клітини вібріонів вигнуті на 1/3–1/4 обороти. Довжина клітин складає 1–3 мкм.

Спірили (рід Spirillum) – клітини, що вигнуті на 2–3 обороту, мають форму латинської букви S. Розміри клітин у порівнянні з вібріонами значно крупніше – 15–20 мкм.

Спірохети (рід Spirochaeta) представлені дуже тонкими довгими клітинами штопороподібної форми з великим числом дрібних витків. Довжина клітин перевищує ширину в 5–200 разів. Число витків спіралі є одним із систематичних ознак для визначення виду.

Нитчасті форми бактерій являють собою ланцюжки циліндричних кліток, часто оточені загальним чохлом.

Актиноміцети – променисті грибки, займають проміжне положення між бактеріями й грибами. Вони одноклітинні, як бактерії, й утворюють гіллястий міцелій з довгими та розгалуженими нитками (гіфами), як у цвілевих грибів.

Бактерії незвичайної форми морфологічно різноманітні – тороідальні (замкнені та незамкнені кільця), зіркоподібні, тубероідальні (паличкоподібні бактерії зі сферичним роздуттям), червоподібні із загостреними кінцями, стеблові, плоскі у вигляді квадратних пластинок або інших геометричних форм.

Багато представників бактерій – рухливі організми. З характеру розташування й числу джгутиків розрізняють монотрихи – бактерії з одним джгутиком на одному з кінців клітини; лофотрихи – бактерії з декількома джгутиками, розташованими на одному з кінців клітини, амфітрихи – бактерії з полярним джгутикованням на двох кінцях; перитрихи – бактерії з великим числом джгутиків по всій поверхні бактеріальної клітини.

Гриби – одне з найбільших царств еукаріотичних гетеротрофних організмів, різноманітних із будови й способу життя. Об'єктами мікробіології є одноклітинні мікроскопічні гриби – дріжджі, а також деякі цвілеві гриби.

Дріжджові клітини морфологічно досить різноманітні. Вони бувають округлими, овальними, подовженими та лимоноподібними. Клітини дріжджів значно крупніше бактеріальних і досягають у діаметрі 4–10 мкм. Дріжджові клітини – нерухомі, вони мають клітинну стінку, цитоплазму і ясно виражене диференційне ядро. Багатьом дріжджам властиве утворення великих скупчень різної форми, деякі дріжджі можуть утворювати рудиментарний міцелій.

На густих живильних середовищах дріжджі ростуть у вигляді різних опуклих безбарвних, жовтувато-жовтогарячих, рожевих, коричневих, бежевих колоній м'якої консистенції, що не вростають у субстрат. Форма й колір колоній мають значення для діагностики дріжджів. Більшість дріжджів розмножуються брунькуванням. До дріжджів, що брунькуються, відносяться представники роду Saccharomyces. Ряд дріжджів розмножується поділом (Shizosaccharomyces). Дріжджі, у яких спостерігається статевий процес, зв'язаний зі спороутворенням, називаються справжніми дріжджами і відносяться до аскоміцетів. Аспорогенні дріжджоподібні організми відносяться до недосконалих грибів (Candida, Torulopsis, Endomyces, Oidium і ін. )

Цвілеві гриби поширено повсюдно. Особливо багато їх у ґрунті й у місцях із підвищеною вологістю. Цвілеві гриби мають велике значення як продуценти багатьох цінних речовин – ферментів, антибіотиків, органічних кислот і інших продуктів. За назвою “цвілеві гриби” поєднуються деякі представники зигоміцетів, недосконалих і сумчастих грибів. На густих субстратах цвілі утворюють округлі пухнасті, нитковидні, павутиноподібні, ватоподібні і порошкоподібні колонії зеленого, жовтуватого, чорного чи білого кольору. Колонії цвілій складаються з великої кількості гіллястих ниток, що називаються гіфами. Велика частина гіфів розвивається в повітрі, а частина в товщі субстрату. Система гіфів у цілому утворює міцелій. У порівнянні з розмірами бактерій діаметр ниток більшості цвілій досить великий і коливається від 5 до 50 мкм і більш. Гіфи часто видно неозброєним оком. Міцелій представників зигоміцетів не має поперечних перегородок (септ), міцелій інших плісеней септований. У плісеней мається диференційне ядро, причому міцелій зигоміцетів багатоядерний. У зигоміцетів (Mucor) на вільних кінцях плодоносних гіфів (спорангієфорах) в особливих кулястих тільцях (спорангіях) утворюються ендоспори. У представників аскоміцетів і недосконалих грибів (Aspergillus, Penicillium) конідієспори (конідії) також утворюються на вільних кінцях плодоносних гіфів, але є екзогенними, тому що вони не укладені в спорангій, а формуються на поверхні конідієфора, складаючи іноді довгі ланцюжки на зразок намиста. Плодоносні гіфи розташовуються в повітряному міцелії.

Найпростіші (Protozoa) – це одноклітинні організми, що є найбільш просто організованими представниками царства тварин. Морфологічно найпростіші дуже різноманітні. Розміри клітин найпростіших коливаються в широких межах у залежності від видової приналежності і фізіологічного стану. Більшість найпростіших у сотні разів крупніше багатьох бактерій. До найпростіших відноситься до 15 тисяч видів. З них близько 12 тисяч видів є сапрофітними формами, що живуть у ґрунті та воді, інші – паразитами людини й тварин. Мікробіологи мають справу з обмеженим числом представників, в основному, збудниками різних захворювань людини: дизентерійною амебою, малярійним плазмодієм, окремими видами трипаносом, лейшманіями і деякими іншими.

Порядок виконання роботи

1. Для вивчення морфології бактерій заздалегідь приготувати настої різних природних субстратів: м'яса, риби, білка яйця, сіна, борошна, овочів, фруктів і ін. Невелику кількість матеріалу подрібнюють, поміщають у склянку, на кінчику скальпеля додають трохи крейди і заливають водопровідною водою на 2/3 об’єму склянки. Склянку з настоєм витримують у термостаті при температурі 25-28°С (чи в теплому приміщенні в темряві 3-5 днів). За цей час у середовищі накопичується маса різноманітних мікроорганізмів.

2. Приготувати та дослідити препарати живих клітин мікроорганізмів із природних субстратів:

- За методом «роздавленої краплі» – із кисломолочних продуктів (ацидофіліну, чи кисляку кефіру) і ін.

- «Висяча крапля» – із гнилого м'яса, риби, настою біогумусу.

В обох випадках можливе забарвлення об'єкта «прижиттєвими» барвниками – вітальне фарбування. Як прижиттєві барвники можна використовувати метиленовий синій, нейтральний червоний у концентраціях від 0,001 до 0,0001 %.

3. Паралельно з рідини настоїв приготувати фіксовані та забарвлені (простим способом) препарати мікроорганізмів. Зробити мікроскопію спочатку із сухим об'єктивом 40х, потім переглянути, використовуючи імерсійну систему (об'єктив 90х).

4. Для вивчення морфології бактерій приготувати препарати з використанням колекції чистих культур різних морфологічних груп. Препарати розглянути з імерсією, відзначити форму й сполучення клітин різних мікроорганізмів.

5. Приготувати фіксований препарат-мазок із зубного нальоту. На предметне скло нанести бактеріологічною петлею краплю стерильного фізіологічного розчину чи водопровідної води, потім обережно знімають зубний наліт сірником, розтирають у краплі води та тонким шаром розподіляють на поверхні чистого знежиреного скла. Мазок підсушують у повітрі, фіксують і зафарблюють, розглядають з імерсією.

Усі переглянуті під мікроскопом препарати замалювати. Під кожним малюнком указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів і збільшення мікроскопа, із яким розглядався препарат.

6. Приготувати й виконати мікроскопію клітин дріжджів Saccharomyces cereviceae, та дріжджоподібних грибів Candida tropicalis, Oidium lactis у препараті “роздавлена крапля” й провести їхнє прижиттєве забарвлення метиленовим синім у розведенні 1:40. Розглянути клітини дріжджів, що брунькуються й діляться.

Методи виявлення живих і мертвих мікробних клітин засновані на різному прониканні барвника, що характеризується різним фізіологічним станом клітини. Виявлення живих і мертвих клітин грибів проводять на вітальних (прижиттєвих) препаратах за допомогою метиленового синього. Для цього на предметне скло в краплю мікробної суспензії вносять краплю барвника метиленового синього, витримують не більш однієї хвилини, накривають покривним склом, забирають надлишок рідини фільтрувальним папером і виконують мікроскопію у прохідному світлі. Живі клітини, що не пропускають барвник, не забарвлюються, мертві клітини синього кольору.

7. Розглянути колонії грибів Mucor mucedo, Aspergillus niger, Penicillum cyclopium. Колонії грибів розглядають у мікроскоп з об'єктивом 8х безпосередньо у відкритій чашці Петрі.

8. Приготувати препарат “роздавлена крапля” цвілевих грибів Mucor, Aspergillus, Penicillium і вивчити будову їхніх спорангіїв, конідій і конідієносіїв.

Міцелій грибів погано змочується водою, тому препарат готують у суміші спирту з гліцерином (1:1) чи води з оцтовою кислотою (1:1). Для дослідження грибів на добре знежирене предметне скло наносять краплю суміші. За допомогою двох препарувальних голок у цю краплю обережно переносять шматочок міцелію цвілевого гриба, обережно, не порушуючи структури міцелію, розправляють гіфи та органи, що плодоносять. Перед тим як покласти покривне скло, розглянути препарат із невеликим збільшенням. Потім краплю накривають покривним склом і злегка придавлюють. Дослідження проводять у світловому мікроскопі з використанням об'єктивів 8х і 40х у затемненому полі зору, для чого звужують діафрагму чи опускають конденсор. Для кращої видимості будови міцелію в краплю під покривне скло можна додати невелику кількість фарби (одну краплю фуксину чи метиленової сині). Міцеліальні гриби можуть бути ідентифіковані з характерного спороношення.

У дослідженні культури мукорової цвілі звернути увагу на наявність несептованого міцелію, від якого відходять несептовані спорангієносії з кулястим розширенням угорі (спорангієм), що наповнений ендоспорами.

В аспергілових плісеней гіфи септованого міцелію, переплітаючись один з одним, утворюють густу грибницю, від якої відходять одноклітинні конідієносії, що закінчуються віялоподібним розширенням (стерігми зі спорами – конідії).

По закінченні роботи предметні та покривні стекла із препаратами перш, ніж вимити, продезінфікувати. Результати спостережень відобразити у вигляді малюнків. Указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів.