Зміст лекції

1. Предмет і задачі генної інженерії, історія розвитку. Генна інженерія — це сукупність прийомів, методів і технологій створення рекомбінантних ДНК, виділення генів із клітин, здійснення маніпуляцій з генами і введення їх в інші організми.

Генна інженерія є інструментом біотехнології. Особливістю генної інженерії є здатність створювати структури ДІЖ, яких ніколи не було в живій природі. Г енна інженерія відкрила перспективи створення мікроорганізмів, рослин і тварин з новими корисними властивостями.

Одним з важливих напрямів генної інженерії є створення ліків нового покоління, що є біологічно активними білками людини.

Генна інженерія використовує досягнення таких наук, як молекулярна біологія, цитологія, генетика, мікробіологія.

Датою появи генної інженерії вважають 1973 p., коли Г. Бойер і С. Коен створили першу рекомбінантну ДНК, що містила фрагменти ДНК фага X Е.соїі і вірусу SV40 мавпи.

Етапи розвитку генної інженерії пов’язані з такими досягненнями:

- створення рекомбінантних молекул ДНК in vitro (одержання гібридів плазмід із різних штамів бактерій);

- одержання рекомбінантних молекул ДНК між хромосомними генами прокаріот і різними плазмідами;

- введення генів тварин у векторні молекули ДНК.

Основним завданням генної інженерії є конструювання in vitro функціонально активних генетичних структур - рекомбінантних ДНК.

В експериментах з рекомбінантною ДНК була одержана основна частина інформації про структуру гена.

Технологія рекомбінантних ДІІК включає такі методи:

- виділення нуклеїнових кислот;

- виділення генів;

- хімічний синтез генів;

- створення векторів;

- конструювання рекомбінантної ДНК;

- введення рекомбінантної ДНК у клітини або організми

(трансформація);

- ідентифікація клітин, що несуть рекомбінантну ДНК;

- клонування ДНК;

- ампліфікація ДНК;

- секвенування.

2. Виділення нуклеїнових кислот. Генно-інженерні роботи розпочинаються з одержання препаратів високоочищених нуклеїнових кислот. Сучасні методи виділення нуклеїнових кислот містять такі етапи:

1) руйнування клітин;

2) інактивація нуклєаз для запобігання розщепленню нуклеїнових кислот;

3) очистка виділених нуклеїнових кислот.

Зі зруйнованих клітин одержують хромосоми. Цей процес здійснюють автоматично в цитометрах. Сучасні методи дозволяють одержати за добу 7,5- V07 індивідуальних хромосом людини.

Під час виділення нуклеїнових кислот до складу буферних розчинів для руйнування клітин уводять інгібітори нуклєаз. Як інгібітори нуклєаз використовують неспецифічні денатуруючі агенти (іонні деіергенги, гуанідинхлорид, фенол, хлороформ), а також специфічні інгібітори (ванадієві комплекси рибонуклеозидів або інгібітор РНКази і з плаценти людини).

Для відокремлення домішок РНК від ДНК використовують високоочищєні препарати ферменгів РНКаз (найчастіше панкреатичну РНК азу), а під час виділення РНК - препарати ДНКаз. У процесі використання методів виділення ДНК із тканин тварин одночасно виділяєгься мітохондріальна та ядерна ДНК. Якщо необхідно виділити ядерну ДНК, спочатку одержують ядра клітин, якщо мітохондріальну —

мітохондрії.

Для очищення ДНК від білків (депротеїнізації) застосовують протеолітичні ферменти (протеїназу К із Trirachium album або протеїназу із Streptomyces griseus), фенол, хлороформ.

Для додаткового очищення плазмідної ДНК іноді застосовують гель- фільтрацію або електрофорез в аіарозному гелі. Для очищення еукаріотичної мРНК застосовують метод афінної хроматографії на оліго(сіТ)-целюлозі.

3. Структурна організація геномів. Першим об’єктом дослідження генетики мікроорганізмів була плісень Neurospora crassa, потім стали гриби, бактерії і віруси бактерій (бактеріофаги). Найбільш вдалим виявився штам К-12 Escherichia coli, тому що до складу бактеріальної культури входив, як виявилося пізніше, профаг X, майбутній класичний об’єкт генетичної інженерії. Крім того, в цих же клітинах були виявлені плазміди так званого статевого фактора, що прискорило відкриття статевого процесу у бактерій.

Відкриття нуклеїнових кислот стало поштовхом до широкого вивчення їх складу та властивостей. А.Коссель у кінці XIX століття визначив окремі складові частини цих кислот. З гідролізату нуклеїнових кислот він одержав невідомі раніше речовини - аденін та ксантин. Остання була не мономіром нуклеїнової кислоти, а продуктом перетворення іншого мономіра - гуаніну (рис. 1). У подальших дослідженнях А.Коссель виявив у нуклеїнових кислотах тимін і цитозин, які належать до класу піримідинів. У 1890 році Аскалі виділив з нуклеїнових кислот ще одну основу - урацил.

Аденін (6-амінопурин) Гуанін (2-аміно-6-оксипурин)

Рис. 1. Пуринові основи

До кінця XIX століття стало відомо, що нуклеїнові кислоти містять дві пуринові основи - аденін і гуанін та три піримідинові - тимін, цитозин і урацил. Крім цього, в гідролізаті виявлено велику кількість фосфатної кислоти та вуглеводів. Р.Левен виділив і кристалізував вуглеводний компонент нуклеїнової кислоти дріжджів. Ним виявився моноцукорид Б-рибоза. Пізніше виділено ще один моноцукорид з класу пентоз - дезоксирибоза. Нуклеїнові кислоти, що містили дезоксирибозу, стали називатися дезоксирибонуклеїновими, або скорочено ДНК, а ті, що містили рибозу - рибонуклеїновими, або РНК.

У 1944 році М.Макарті й М.Евері довели, що ДНК є носієм спадковості. Це послужило поштовхом до подальших досліджень її структури. Одним із перших дослідників у цьому напрямку був Чаргафф. Вивчаючи нуклеотидний склад ДНК з різних тварин та організмів, він одержав результати, на основі яких сформулював правила:

1) число основ з аміногру-пами у шостій позиції дорівнює числу основ з кетогрупами у тій же позиції, тобто А (аденін) + Ц (цитозин) = Г (гуанін) + Т (тимін). Це єдине правило, стосовно до ДНК і до більшості РНК, в яких Т замінений на У (урацил);

2) молекулярний вміст аденіну дорівнює молекуляр­ному вмістові тиміну (А=Т, або А/Т = 1);

3) молекулярний вміст гуаніну дорівнює молекуляр­ному вмістові цитозину (Г=Ц або Г/Ц = 1);

4) сума пуринових основ дорівнює сумі піримідинових основ, тобто А+Г = Т+Ц;

5) у бактерій відношення А/T і Г/Ц близькі до одиниці, тоді як відношення А/Г змінюється в інтервалі 0,4 - 2,7. Інтервал зміни А/Г для рослин (1,1 - 1,7) і тварин (1,3 - 2,2) менший, ніж для ДНК бактерій. За співвідношенням нуклеотидів виділені АТ - тип ДНК (А+Т > Г+Ц) і ГЦ - тип ДНК (Г+Ц > А+Т).

Ці дані вчений одержав у 1950 році, хоча не зміг пояснити значення відкритих ним правил. Це зробили в 1953 році Дж.Уотсон і Ф.Крік. Вчені застосували метод моделювання структур молекул з урахуванням рентге­нограм ДНК, одержаних М.Уілкінсом і Р.Френклін. Виходячи з аналізу рентгенограм, Дж.Уотсон і Ф.Крік зрозуміли, що структура ДНК знаходиться в спіралізованій формі.

Така модель пояснювала суть правил Чаргаффа. У клітинах всіх типів живих організмів ДНК перебуває у зв’язаному з білками стані. Найбільше до складу білкових компонентів входять гістони, які представлені двома фракціями:

1. “багаті на лізин” з молекулярною масою 10000; “багаті на аргінін” з молекулярною масою 20000. В цілому ж дезоксирибозопротеїдимістять біля 50% ДНК, а решта припадає на білок. Дж.Уотсон і Ф.Крік не тільки доказали, що молекула ДНК є біспіральною та її ланцюги комплементарні, тобто доповнюють один одного, а й дослідили процес передачі спадкової інформації - в ході реплікації (подвоєння) ланцюги ДНК розходяться і на кожному з них добудовується комплементарний новий поліну клеотид ний ланцюг. Старий ланцюг служить матрицею для синтезу нового. Так множиться спадкова інформація в клітинах живих організмів. Ця модель Уотсона-Кріка одержала експериментальне підтвердження в роботах відомого вченого А.Корнберга, який вивчав ензимологію реплікації ДНК і відкрив фермент ДНК-полімеразу, що стала основною догмою молекулярної біології та генетики.

Згідно з такою моделлю полінуклеотидні ланцюги анти-паралельні, тобто йдуть в проти-лежних напрямах: один ланцюг йде у напрямку 5'—>3а другий - у напрямі З'—>5'. Місця приєднання азотистих основ до залишків дезоксиробози в комплементарних ланцюгах ДНК розташовані не суворо один проти одного стосовно осі спіралі. Це позначається на всій комформації ДНК. З одного боку від осі спіралі, де кут між дезоксирибозними кільцями менше 180°, міститься жолоб, іменований малою, чи глікозидною, борозною (у 11 бік спрямовані глікозидні зв’язки, що з’єднують дезоксирибозні залишки з азотистими основами); з протилежного боку знаходиться велика борозна, або неглікозидний жолоб.

ДНК- речовина білого кольору волокнистої структури, погано розчинна у воді. Солі її лужних металів, навпаки, добре розчинні у воді. Розчини ДНК мають досить високу в’язкість, оптично активні - повертають площину поляризації світла вправо. В’язкість розчинів та оптична активність зменшуються при зниженні ступеня впорядкованості подвійної спіралі ДНК. Для ДНК характерною є здатність до поглинання світла при 260 нм в ультрафіолетовій ділянці спектра. Порушення нативносгі молекули супроводжується підвищенням поглинання світла, За підвищеної температури (в межах незначного температурного інтервалу) дволанцюгова молекула ДНК дестабілізується, ланцюги розходяться і розриваються зв’язки між парами комплементарних основ. Це явище називається денатурацією, або плавленням. Температура, при якій ДНК денатурована на 50%, називається температурою плавлення. Температура плавлення ДНК різних організмів різна і залежить від співвідношення А-Т- і Г-Ц-пар (чим більший вміст Г-Ц-пар, тим вища температура плавлення, що, можливо, пов’язано із взаємодією пурин-піримідинових основ у ДНК. Молекула ДНК за денатурації набуває форми безладно згорнутого клубка (перехід “спіраль-клубок”). За швидкого охолодження розчину денатурованої ДНК ланцюги залишаються в дестабілізованому стані, за повільного - може відновитися нативна структура ДНК. Для ДНК характерні певні хімічні властивості. Це, насамперед, взаємодія з нітратною кислотою, внаслідок чого аденін перетворюється на гіпоксантин.

Модель структури ДНК Дж.Уотсона і Ф.Кріка дозволяє пояснити молекулярні механізми генетичної рекомбінації, яка є важливою функцією ДНК. Зі сучасних позицій рекомбінація двох хромосом може розглядатися як обмін ділянками між двома дволанцюговими молекулами ДНК. Рекомбінація проходить в тих ділянках взаємодіючих хромосом, де їх нуклеотидні послідовності близькі або ідентичні.

Важливе значення для обґрунтування молекулярних механізмів рекомбінації є відомості про ферменти, які необхідні для реалізації рекомбінації. До них відносяться, в першу чергу, ендонуклеази, ДНК-полімерази тощо. Дані про участь в рекомбінації одних і тих же ферментів були вперше одержані в 1965 році А.Кларком, який відкрив Яес мутанти Е.соїі, що нездатні до генетичної рекомбінації.

Реплікація ДНК (редуплікація, автореплікація) - біосинтез дочірніх ланцюгів ДНК на вихідній матриці, що обумовлює точне відтворення генетичної інформації. У середовищі для реплікації одночасно з ДНК-полімеразою І має бути повний набір дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатів (а-АТФ, а-ІТФ, а-ТТФ, а-ЦТФ), йони магнію, затравочний ланцюг з вільним 3'-ОН-кінцем (роль затравки виконує попередній ланцюг ДНК чи РНК), матричний ланцюг, у ролі якого може бути одно- або дволанцюгова ДНК.

Умовою реплікації є необхідність розплітання подвійної спіралі батьківської ДНК у ділянці реплікованої вилки за участю ферменту rep (гелікази). Позитивні супервитки, що виникають при розплітанні кільцевої ДНК, долаються за участю ферменту ДНК-гірази.