Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии

Во всех случаях получение эритропоэтина ограничивается трудностями, связанными с выделением и культивированием клеток, нестабильностью продукции гормона и, наконец, низкой концентрацией его в культуральных жидкостях.

Принципиально иной подход к получению больших количеств высоко очищенного эритропоэтина был связан с применением методов генной и клеточной инженерии. Была сделана попытка создания бактериального продуцента эритропоэтина (Lee-Huang S., 1984). Продуцируемый в Escherichia coli белок узнается антителами против эритропоэтина и имеет молекулярную массу, примерно соответствующую дегликозилированному эритропоэтину человека. Известно, что бактериальные клетки имеют систему гликозилирования, принципиально отличающуюся от эукариотической. Поэтому получить корректно гликозилированный белок в бактериальных клетках невозможно. В случае эритропоэтина получение корректно гликозилированного гликопротеида имеет принципиальное значение и, следовательно, создание продуцента гормонана основе бактериальных клеток является нецелесообразным.

Эффективный продуцент биологически активного как in vitro, так и in vivo эритропоэтина может быть получен только на основе клеток высших животных. Сделана попытка получения эритропоэтина человека на основе клеток насекомых (Wojchowski D. et al., 1987). Для экспрессии гена эритропоэтина в данном случае был использован вектор на основе бакуловируса. Секретируемый клетками насекомых эритропоэтин имеет молекулярную массу намного ниже, чем нативный эритропоэтин человека, то есть корректного гликозилирования в данной системе также не происходит. Полученный в этой работе эритропоэтин проявляет биологическую активность, по крайней мере, в тестах in vitro. О биологической активности и стабильности in vivo рекомбинантного эритропоэтина, продуцируемого клетками насекомых, в данной работе не сообщается.

В работе Lin F.-K. et al., 1985 впервые cообщается о получении стабильно трансфецированных клеток линии СНО (эпителио-подобные клетки из яичника китайского хомячка), продуцирующих эритропоэтин человека. В данном случае для трансфекции клеток использовали плазмиду, содержащую ген эритропоэтина человека под контролем промотора поздних генов вируса SV40. Полученные стабильные клоны секретировали эритропоэтин в концентрации примерно 18 ед./мл. Было показано, что рекомбинантный эритропоэтин, продуцируемый клетками млекопитающих, обладает биологической активностью как в тестах in vitro, так и в тестах in vivo.

Для получения высоко эффективного продуцента эритропоэтина человека в работе Powell J. et al., 1986 использовали систему амплификации интегрированных плазмид в трансфецированных клетках линии ВНК (клетки из почки хомячка). Для этого проводили ко-трансфекцию клеток двумя плазмидами, одна из которых содержала ген эритропоэтина человека под контролем вирусного промотора, а другая - ген дигидрофолатредуктазы. Амплификация интегрированных плазмид достигалась путем культивирования клеток на среде с постоянно повышающимися концентрациями метотрексата. Полученный в данной работе продуцент секретировал до 80 мг/л эритропоэтина человека.

Аналогичная работа была проведена в СССР в НПЦ медицинской биотехнологии (Крамерова И.А. и др., 1988, Крамерова И.А. и др., 1989, Крамерова И.А. и др., 1989а). Используя олигонуклеотидный зонд, было проведено клонирование гена эритропоэтина человека, созданы эффективные векторы экспрессии, получены высоко продуктивные клеточные линии, секретирующие рекомбинантынй эритропоэтин человека, и разработаны методы выделения гормона из культуральной жидкости клеток-продуцентов. Полученный препарат прошел успешные предклинические испытания и подготовлен для испытания в клинике.

Исследование механизмов взаимодействия эритропоэтина с клетками- мишенями долгое время было невозможно из-за отсутствия радиоактивно меченого эритропоэтина, сохраняющего биологическую активность (Goldwasser E., 1981). Эта проблема было решена благодаря получению рекомбинантного эритропоэтина. Меченый эритропоэтин получают несколькими способами:

1) мечение тритием по углеродной части (Krantz S., Goldwasser E., 1984);

2) иодирование (Sawyer S. et al., 1987, Todokoro K. et al., 1987);

3) включение меченных радиоактивной серой аминокислот в процессе биосинтеза рекомбинантного эритропоэтина в трансфецированных клетках (Mufson P., Gesner T., 1987

Генно-инженерные (рекомбинантные вакцины):

Генно-инженерные вакцины содержат антигены возбудителей, полученные с использованием методов генной инженерии, и включают только высокоиммуногенные компоненты, способствующие формированию защитного иммунитета. Возможны несколько вариантов создания генно-инженерных вакцин.

• Внесение генов вирулентности в авирулентные или слабовирулентные микроорганизмы.
• Внесение генов вирулентности в неродственные микроорганизмы с последующим выделением Аг и его использованием в качестве иммуногена.
• Искусственное удаление генов вирулентности и использование модифицированных организмов в виде корпускулярных вакцин.

Ряд современных противовирусных вакцин сконструирован путём введения генов, кодируюших основные Аг патогенных вирусов и бактерий в геном вируса осповакцины (HBsAg вируса гепатита В(ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА В (Hepatitis В surface antigen - HBsAg) - антиген, составляющий наружную оболочку вируса гепатита В (ВГВ).) и непатогенных для человека сальмонелл (HBsAg вируса гепатита В и Аг токсина столбнячной палочки). Другим примером служит введение генов возбудителя туберкулёза в вакцинный штамм БЦЖ, что придаёт ему большую активность в качестве дивергентной вакцины. Такие препараты известны как векторные вакцины.

Для активной иммунопрофилактики гепатита В также предложена вакцина, представляющая собой HBsAg вируса. Его получают из дрожжевых клеток, в которые введён вирусный ген (в форме плазмиды), кодирующий синтез HBsAg. Препарат очищают от дрожжевых белков и используют для иммунизации. В качестве метода более быстрой и дешёвой наработки бактериальных экзотоксинов в настоящее время разработаны методы их получения при помощи неприхотливых микроорганизмов, в геном которых искусственно внесены гены токсинообразования (например, в виде плазмид).

Селективное удаление генов вирулентности открывает широкие перспективы для получения стойко аттенуированных штаммов шигелл, токсикогенных кишечных палочек, возбудителей брюшного тифа, холеры и других диареегенных бактерий. Возникает возможность создания поливалентных вакцин для профилактики кишечных инфекций, вводимых внутрь. Другим важным направлением выступает возможность получения аттенуированных штаммов возбудителя туберкулёза человека и их использования в качестве вакцин.