Зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК от концентрации агарозы или акриламида в геле

Процесс разделения прекращается, когда размер глобул превышает максимально возможный размер пор. В таких случаях используют электрофорез с пульсирующим электрическим полем или электрофорез с инверсией поля, которые позволяют разделять молекулы ДНК размером до 2000 т.п.н.

В методе гль-электрофореза в пульсирующем поле используются два взаимно перпендикулярных электрических поля, включающихся попеременно. Молекулы ДНК движутся в таких полях в обоих направлениях, поэтому траектория их движения искривлена, что составляет определенные неудобства при анализе данных. Указанный недостаток отсутствует в ветоде с инверсией электрического поля. В этом случае направление поля периодически меняется на противоположное, и молекулы ДНК движутся вперед-назад с паузой между двумя импульсами. Такой режим помогает преодолевать поры геля даже большим молекулам ДНК, которые при этом движутся по прямой линии.

Для электрофореза двунитевых молекул ДНК используют обычно 50 мМ Трис-боратный буфер рн 7,5 – 7,8, а разделение однонитевых ДНК вудут в денатурирующих условиях (NaOH в агарозном геле, мочевина и формамид в полиакриламидном геле). В препараты ДНК добавляют интеркалирующее вещество этидиум бромид, который флюорисцирует под действием УФ - света, позволяя выявить до 0,05 мкг двунитевых ДНК в одной зоне. Однонитевые ДНК выявляются значительно хуже. Оценку размеров ДНК в зонах производят, опираясь на данные о размерах рестриктов секвенированных молекул ДНК. Как правило, в качестве реперных фрагментов известной длины используют рестрикты ДНК фага лямбда, для которых предназначают одну из дорожек гелевой пластинки. Они позволяют определить размеры рестриктов изучаемой ДНК. Кроме того, зная концентрацию реперной ДНК, можно по степени интенсивности зон сделать оценку количества ДНК в изучаемых препаратах.

Гель-электрофорез используется не только для аналитических, но и для препоративных целей. Отмечено также, что связывание белка с ДНК уменьшает его электрофоретическую подвижность, позволяя таким образом изучать особенности взаимодействия бело – ДНК.

Блотинг нуклеиновых кислот (Рыбчин….С. 465 – 467)

Термин блотинг применяют к процедуре иммобилизации нуклеиновых кислот или белков на твердой подложке, обычно на нейлоновых или нитроцеллюлозных мембранах. Иммобилизованные ДНК и РНК используют в последующих гибридизационных экспериментах с целью детекции специфических последовательностей. Техника блотинга различна для разных источников нуклеиновых кислот. Блот по Саузерну и нозерн блот используют, соответственно, для извлечения ДНК И РНК из геля. Иммобилизацию ДНК из раствора ведут методом дот блотинга. Процедура блотинга содержится и в методе гибридизации колоний при скрининге банка генов.

Саузерн предложил оригинальную идею по переносу фрагментов ДНК из агарозного геля на гибридизационную мембрану. Гель помещают на фильтровальную бумагу, находящуюся в контакте с буфером. Мембрану накладывают на гель, а сверху укладывают несколько слоев фильтровальной бумаги, легко адсорбирующей влагу. Бумага служит своеобразным капиллярным насосом, способствуя вымыванию фрагментов ДНК током буфера из геля и переносу их на мембрану. Далее ДНК денатурируют щелочью, а мембрану выдерживают при 80^оС или облучают УФ-светом, что позволяет фиксировать ДНК на мембране. Затем мембрану помещают в раствор с меченным зондом, в котором проходит гибридизация. После отмывки несвязавшейся радиоактивности результат выявляют с помощью радиоавтографии.

Стандартные условия блотинга по Саузерну не применимы к РНК, так как она не связывается с обычными нитроцеллюлозными и нейлоновыми мембранами. Для иммобилизации РНК вначале был предложен специальный вид бумаги с диазобензилоксиметилом, а затем были найдены условия для нековалентного связывания РНК с нитроцеллюлозой (предварительная денатурация РНК ДМСО, формальдегидом и др.) и разработаны для этого подходящие нейлоновые фильтры. По аналогии с блотингом по Саузенру этот вид блотинга был назван нозерн. В продолжении этой аналогии метод переноса белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозные или нейлоновые мембраны был назван вестерн.

В описанных видах блотинга для организации потока нуклеиновых кислот и белков через гель к мембране вместо капиллярных сил используют также электрофорез и вакуум.