2015-10-13
150
2.1. Животные
Самцы крыс линии Вистар (180-200 г) были получены из Национального центра лабораторных животных, Университет Махидол, Салайя, Накорнпатхом. Они находились в виварии факультета фармацевтических наук Университета Чулалонгкорна в контролируемых условиях окружающей среды (температура в помещении 25±1оС, 12-часовой цикл света/темноты, относительная влажность воздуха, примерно равная 60%) при свободном доступе к стандартному гранулированному корму для крыс и водопроводной воде. До начала экспериментов крысы акклиматизировались в течение 3 дней.
Таблица 1.
Защитный эффект РЕ, добавляемого совместно с этанолом в первичные культуры гепатоцитов крысы
| Процедура | МТТа (%) | МТТа (%) | АСТа (Ед/л) | АЛТа (Ед/л) |
| Контроль | - | 12,2 ± 0,8 | 2,8 ± 0,5 | |
| Этанол (Э) | 30,1 ± 2,0* | 24,6 ± 2,2* | 10,1 ± 1,1* | |
| Э + РЕ 0,5 мг/мл | 72,7 ± 3,1*,** | 248,2 ± 10,6** | 23,4 ± 2,6* | 6,7 ± 0,6*,** |
| Э + РЕ 1,0 мг/мл | 86,2 ± 3,8*,** | 303,8 ± 12,2** | 21,3 ± 2,2* | 8,4 ± 0,6* |
а Значения являются средними ± SEM (стандартная ошибка среднего), n = 8.
* Значимое различие с контролем (p < 0,05).
|
|
|
** Значимое различие с этанолом (p < 0,05).
2.2. Исследованные композиции
Свежие плоды РЕ экстрагировали 50%-ным этанолом, затем выпаривали до сухости и хранили при 20оС. Силимарин (СЛ) был любезно предоставлен компанией The British Dispensary (L.P.) Co. Ltd.
2.3. Экспериментальная процедура с использованием первичных культур гепатоцитов крыс
Первичные культуры гепатоцитов крыс получали так, как описано ранее в работе Pramyothin et al. (2005). После 24-часового культивирования гепатоциты обрабатывали этанолом (96 мкл/мл) и РЕ (0,5 и 1 мг/мл) в течение 2 ч. После 2-часовой инкубации жизнеспособность клеток исследовали с помощью МТТ-анализа и определения выделения АЛТ и АСТ.
Все эксперименты были выполнены, по меньшей мере, три раза с использованием различных препаратов клеток.
2.4. Определение жизнеспособности клеток в первичных культурах гепатоцитов крыс
2.4.1. МТТ-анализ
Анализ с использованием МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида] основан на умении жизнеспособных клеток восстанавливать МТТ из желтого водорастворимого красителя до темно-синего нерастворимого формазанового продукта (Mossman, 1983). MTT растворяли в фосфатном буферном растворе (ФБР) в концентрации, равной 5 мг/мл, и добавляли к клеточной культуре до конечной концентрации, равной 100 мкмл. Через 1 час среду удаляли, а оставшиеся кристаллы МТТ растворяли в 100 мкл ДМСО. Оптическую плотность оценивали с использованием считывающего устройства для микропланшетов при длине волны 570/620 нм.
2.4.2. Определение выделения АЛТ и АСТ
Содержание АЛТ и АСТ в среде оценивали с использованием набора производства компании CPT diagnostics. Активность трансаминаз измеряли как кинетическую реакцию с использованием метода IFCC (Международной федерации по клинической химии и лабораторной медицине). Оптическую плотность во время реакции определяли при 340 нм с помощью спектрофотометра.
|
|
|
2.5. Экспериментальная процедура на крысах
Данное исследование было разделено на две части, относившихся к острому повреждению печени высокой однократной дозой этанола и подострому повреждению многократными дозами этанола. В первой части крыс случайным образом разделили на шесть групп, содержавших по восемь крыс в каждой группе. Группа 1 была контрольной, Группа 2 получила 5 г/кг этанола, Группы 3-5 и 6 обработали РЕ (25, 50, 75 мг/кг, перорально) и СЛ (5 мг/кг, перорально), соответственно, за 4 часа до получения разовой оральной дозы (5 г/кг) этанола. Во второй части крыс случайным образом разделили на пять групп, содержавших по восемь крыс в каждой группе. Группа 1 была контрольной, Группа 2 получала этанол в дозе 4 г/кг/день перорально в течение 21 дня, Группы 3-5 получали этанол в дозе 4 г/кг/день перорально в течение 21 дня, затем Группу 3 оставили на 7 дней, тогда как Группы 4 и 5 получали, соответственно, РЕ в дозе 75 мг/кг/день перорально и СЛ в дозе 5 мг/кг/день перорально в течение 7 дней. До начала эксперимента крысы голодали в течение 12 часов. После орального введения последней дозы в каждом из экспериментов крыс наркотизировали эфиром и получали кровь и печень для различных биохимических и гистопатологических исследований.
Таблица 2
Протекторный эффект РЕ (25, 50, 75 мг/кг перорально) и СЛ (5 мг/кг перорально), введенных за 4 часа до разовой токсической дозы этанола (5 г/кг перорально)
| Процедура | АСТ (Ед/л) | АЛТ (Ед/л) | СТГа (мг/дл) | ПТГа (мг/дл) | ФНО-альфаа (пг/мл) | ИЛ-1 бетаа (пг/мл) | Степень тяжести повреждения печениb |
| Контроль | 41,6±0,5 | 20,3±0,6 | 53,8±6,1 | 10,5±0,6 | 103,3±22,6 | 43,8±6,5 | |
| Этанол (Э) | 137,1±9,3* | 42,8±6,2* | 79,1±9,1 | 11,5±2,3 | 188,9±16,7* | 54,5±5,7 | +1 |
| РЕ + Э (25 мг/кг) | 137,6±10,5* | 27,2±2,2** | 80,1±4,7 | 14,0±3,1 | - | - | |
| РЕ + Э (50 мг/кг) | 78,0±3,3*,** | 23,3±0,9** | 67,1±9,1 | 10,9±2,1 | - | - | |
| РЕ + Э (75 мг/кг) | 65,6±3,7* | 20,3±1,5** | 74,0±5,8 | 9,0±1,5 | 118,1±12,8 | 29,3±6,4** | |
| СЛ + Э (5 мг/кг) | 58,1±3,9** | 18,1±0,9** | 84,5±9,2 | 10,8±1,4 | 119,2±10,5 | 39,3±17,1 |
а Значения являются средними ± SEM, n = 8.
b 0, норма; +1, слабая; +2, средняя; +3, тяжелая.
* Значимое различие с контролем (p < 0,05).
** Значимое различие с этанолом (p < 0,05).
Таблица 3
Стимуляция восстановления печени крыс РЕ (75 мг/кг/день) и СЛ (5 мг/кг/день), которые вводили ежедневно в течение 7 дней после получения этанола (4 г/кг/день) в течение 21 дня.
| Процедура | АСТ (Ед/л) | АЛТ (Ед/л) | СТГа (мг/дл) | ПТГа (мг/дл) | ФНО-альфаа (пг/мл) | ИЛ-1 бетаа (пг/мл) | Степень тяжести повреждения печениb |
| Контроль | 45,8±1,0 | 18,8±1,5 | 47,3±16,4 | 7,0±1,1 | 147,3±14,8 | 40,7±5,3 | |
| Этанол (Э) | 74,3±14,1* | 43,1±8,1* | 100,9±16,8* | 10,1±2,1 | 245,8±19,7* | 136,8±22,0* | +3 |
| Э + 7 дней | 40,1±1,8** | 22,8±1,8** | 68,5±11,6 | 4,6±2,6 | 205,4±10,5 | 58,0±9,8** | +1 |
| Э + РЕ (7 дней) | 40,8±1,8** | 14,1±0,7** | 65,0±9,1 | 5,5±0,9 | 186,5±6,9 | 42,6±9,4** | |
| Э + СЛ(7 дней) | 43,8±1,7** | 15,1±0,9** | 62,1±9,8 | 5,5±0,8 | 184,5±26,2 | 48,0±17,2** | +1 |
а Значения являются средними ± SEM, n = 8.
b 0, норма; +1, слабая; +2, средняя; +3, тяжелая.
* Значимое различие с контролем (p < 0,05).
** Значимое различие с этанолом (p < 0,05).
2.6. Оценка повреждения печени крыс
2.6.1. Измерение АСТ и АЛТ в сыворотке и сывороточных триглицеридах (СТГ)
Активность сывороточной аспартат трансаминазы (АСТ) и аланинтранаминазы (АЛТ) определяли методом IFCC с использованием наборов производства компании CPT diagnostics. СТГ определяли с использованием наборов реактивов для определения триглицеридов производства той же компании.
2.6.2. Измерение печеночных триглицеридов (ПТГ)
Экстракцию печеночных триглицеридов проводили в соответствии с процедурой, описанной в работе Mendez et al. (1975).
2.6.3. Измерение цитокинов: ФНО-альфа и ИЛ-1 бета
|
|
|
Концентрации ФНО-альфа и ИЛ-1 бета определяли с использованием наборов для ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) производства компании Pierce Biotechnology Inc.
2.7. Гистопатологическое исследование
После забора крови ту же долю печени немедленно забирали для гистопатологического исследования. Долю печени делили на две части, первую часть разрезали на куски размером порядка 1 см х 1,5 см х 0,5 см и фиксировали в 10%-ном забуференном растворе формалина для окрашивания гематоксилином-эозином (ГиЭ). Вторую часть хранили при -80оС для окрашивания Масляным красным О и PAS. Патологические изменения, связанные с жировой инфильтрацией печени и дегенерацией гепатоцитов, классифицировали следующим образом: 0, норма; +1, слабая степень; +2, средняя степень, и +3, тяжелая степень.
2.8. Статистический анализ
Данные представляли как среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего). Статистическую значимость оценивали с помощью одномерного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки.
