Выделение и очистка ферментов

Строение ферментов, их свойства и функции можно исследовать только при наличии их высокоочищенных препаратов, в которых отсутствуют кофакторы, способные модулировать их конформацию, а, следовательно, структурные и функциональные особенности. Получение белка в гомогенном состоянии – сложная задача, поскольку биологический материал, являющийся источником фермента, содержит множество разных белков и их комплексов. Кроме того, трудности получения чистых ферментов связаны с лабильностью белков и опасностью их денатурации, что снижает число возможных методов выделения, хотя близкие свойства белков в их смеси требуют при выделении индивидуальных белков использования разнообразных методов и различных их сочетаний.

Существует три основные проблемы при выделении ферментов:

1. Исходный материал состоит из множества различных соединений, разделение которых сложно вследствие того, что они построены однотипно и мало различаются между собой по физико-химическим характеристикам (растворимости или способности к сорбции на определенном типе сорбента).

2. Работа с биологическим материалом зачастую сопровождается необходимостью работать с очень небольшими количествами исходного вещества, поэтому методы детекции должны быть высокочувствительными.

3. Многие белки обладают очень низкой устойчивостью, хотя необходимо выделение фермента в нативном состоянии с сохранением его биологической активности. Многие ферменты при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды подвержены денатурации, которая обычно сопровождается их инактивацией. Кроме того, в клетках имеются ферменты, способные разрушить те или иные вещества, в первую очередь белки.

Выбор исходного материала для выделения чистых препаратов фермента определяется целью исследования. Для изучения свойств определенных ферментов, безотносительно источника, выбирают наиболее доступный биологический материал, содержащий большие количества фермента. При исследовании специфических ферментов из конкретных источников используют определенный биологический материал независимо от количества в нем исследуемого фермента, что усложняет процесс его выделения и очистки.